柔肝通络汤预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠脑保护作用*

龙华君　周慎　伍大华　刘雨　唐燕

（1.湖南省中医药研究院附属医院，湖南长沙410006；2.湖南中医药大学，湖南长沙410007）

·研究报告·

柔肝通络汤预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠脑保护作用*

龙华君1周慎1伍大华1刘雨2唐燕2

（1.湖南省中医药研究院附属医院，湖南长沙410006；2.湖南中医药大学，湖南长沙410007）

目的观察柔肝通络汤对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响。方法将SD大鼠分为柔肝通络汤高、中、低剂量组和空白对照组、假手术组、模型组。采用线栓法复制大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤（MCAO）模型，分别观察缺血再灌注后3、6、12、24、48 h神经学评分及再灌24 h脑梗死面积。结果柔肝通络汤能够明显改善模型动物的神经病学症状，缩小脑梗死面积。柔肝通络汤各剂量组的神经功能缺损评分及梗死灶面积均低于模型组（P＜0.05）。结论柔肝通络汤在防治大鼠脑缺血再灌注损伤方面具有脑保护作用。

柔肝通络汤脑缺血再灌注脑梗死面积神经功能评分

脑血管疾病是导致全球人口死亡的三大疾病之一，严重危害人类健康。脑缺血再灌注损伤是指脑缺血恢复血液灌注后，脑细胞损伤反而进行性加重。柔肝通络汤是基于中风肾虚血瘀病机，以益肾生髓、活血通络立法而创制的方剂，从肝肾治脑，肾脑同治，在治疗脑缺血再灌注损伤方面疗效显著［1-2］。本研究探讨了柔肝通络汤对大鼠脑缺血再灌注损伤中神经功能的保护作用。现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物健康雄性SD大鼠176只，体质量为250～300 g，鼠龄为18月。由湖南中医药大学实验动物部提供。

1.2药物柔肝通络汤由制何首乌15 g，桑椹15 g，枸杞子30 g，丹参30 g，葛根30 g，当归尾10 g，赤芍10 g，地龙10 g，山楂15 g组成。药材购自湖南省中医药研究院附属医院，经鉴定为道地药材。一煎加水500 mL，煎汁150 mL；二煎加水300 mL，煎汁150 mL；取2次煎汁混合，文火煎，成膏状（含生药2 g/mL），冷藏备用。

1.3试剂与仪器红四氮唑（TTC）：购自上海钰博生物科技有限公司。水合氯醛：分析纯，购自天津市科密欧化学试剂开发中心。恒温水浴：湖南中医药大学免疫组化教研室提供。

1.4分组及给药将176只大鼠先按体质量大小分层，再采用随机数字表法随机分成6组，其中空白对照组16只，假手术组16只，模型对照组36只，柔肝通络汤低、中、高剂量组各36只。假手术及空白组取2只大鼠、模型组及柔肝通络汤组取6只大鼠用于再灌注24 h的TTC染色。以50 kg成人每日服用柔肝通络汤剂（生药材含量165 g）为剂量参照标准进行换算［3］，柔肝通络汤低、中、高剂量组每日灌胃柔肝通络汤剂分别为7、14、28g/kg生药含量，相当于50kg人等效剂量的0.5倍、1倍、2倍。药物质量浓度均按大鼠1.4 mL/100 g灌胃容量用蒸馏水配制。空白对照组、假手术组与模型组灌胃0.9%氯化钠注射液1.4 mL/100 g。每日1次，连续7 d，最后1次于术前30 min给予。

1.5模型制备采用改良Longa［4］法制作大鼠大脑中动脉堵塞（MACO）模型，假手术组栓线插入深度在15 mm以内，此深度不足以阻断大脑中动脉，其余步骤与模型组相同。术中室温保持在25～30℃，100 W白炽灯照明维持肛温（37.5±0.5）℃。术后消毒皮肤单笼饲养观察，自由饮食。

1.6标本采集与检测1）神经学评分：缺血再灌注动物模型苏醒后，在再灌注3、6、12、24、48 h时间点，按照Longa［4］神经功能缺损评分法进行评分：无神经损伤症状为0分；不能完全伸展对侧前爪为1分；向对侧转圈为2分；向对侧倾倒3分；不能自发行走，意识丧失为4分。2）TTC染色及脑梗死面积的测定：缺血2 h再灌注24 h时，各组大鼠用10%水合氧醛（0.35 mL/ 100 g）腹腔注射深度麻醉后固定大鼠，暴露心脏。钳夹住腹主动脉及下腔静脉，用磨钝的10号针头刺入左心室，先快速滴入0.9%氯化钠注射液约100 mL，后断头取脑，脑组织置于-20℃冰箱约15 min后，去除嗅球、小脑和低位脑干。每个脑组织切成5个连续冠状切片（片厚2 mm），迅速置于1%TTC染液中，37℃避光水浴15 min，每间隔5 min将切片翻动1次。染色后的正常组织为玫瑰红色，梗死组织为白色。将每组脑片排列整齐，拍照保存，应用图像分析软件统计分析，计算脑梗死面积百分比。

1.7统计学处理采用SPSS17.0统计软件处理。计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析。P＜0.05为差异统计学意义。

2　结果

表1　各组大鼠各时间点神经功能缺损评分比较（±s）

表1　各组大鼠各时间点神经功能缺损评分比较（±s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与假手术组比较，△P＜0.01。下同。

组别n空白对照组10假手术组10模型组30再灌注24h时再灌注48h时0 0 0 0 2.83±0.41△2.67±0.82△柔肝通络汤高剂量组301.17±0.41*1.33±0.52*1.50±0.55*2.00±0.63*1.67±0.82*柔肝通络汤中剂量组301.33±0.52*1.50±0.552.00±1.102.33±0.821.67±0.52*柔肝通络汤低剂量组301.33±0.84*1.83±0.752.17±0.412.50±0.552.33±1.03再灌注3h时再灌注6h时再灌注12h时000 000 2.00±0.63△2.17±0.75△2.33±0.82△

2.1各组大鼠神经功能缺损评分比较见表1。模型组与柔肝通络汤高、中、低剂量组大鼠均出现神经功能障碍，假手术组及空白组大鼠未见明显神经学功能损伤。再灌注24 h各组神经功能缺损评分最高，神经功能受损最严重，再灌注48 h时神经功能缺损评分开始降低。与假手术组比较，模型组各时间点大鼠均表现出严重的神经缺损症状（P＜0.01）。与模型组相比，柔肝通络汤高剂量组各时间点神经功能得到了显著改善（P＜0.05），柔肝通络汤中剂量组在再灌注3 h和再灌注48 h神经功能改善作用最好（P＜0.05），柔肝通络汤低剂量组在再灌注3 h时显著改善神经功能（P＜0.05）。2.2各组大鼠脑梗死面积比较见表2，图1。TTC染色结果显示：梗死区主要位于大脑中动脉供血的额顶叶、基底节区等部位。应用图像分析软件统计分析，计算脑梗死面积百分比，发现除空白对照组与假手术组外，各组均呈大小不同的梗死灶。柔肝通络汤低、中、高剂量能显著减少梗死面积，与模型组相比，柔肝通络汤各剂量组差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。

表2　各组大鼠再灌24 h时脑梗死面积比较（±s）

表2　各组大鼠再灌24 h时脑梗死面积比较（±s）

与空白对照组比较，▲P＜0.01。

组别n空白对照组2假手术组2模型组6脑梗死面积（%）00 25.13±2.18△柔肝通络汤高剂量组613.66±4.53**柔肝通络汤中剂量组614.76±3.47**柔肝通络汤低剂量组621.25±1.42*

图1　各组大鼠脑梗死面积比较

3　讨论

缺血性脑卒中占全部脑卒中的60%～80%［5］，脑血管病的预防和治疗已经成为国内外医学工作者和医学研究的重要课题。虽然中医药在降低缺血性脑卒中的致残率、恢复神经功能方面虽有较好的疗效，但对运动、感觉及语言等多项神经功能损伤的恢复差异较大［6-8］。探求恢复受损神经功能的方法和药物是最为理想化的治疗。

近年来的研究认为，缺血中风的病理基础是：虚、风、热、痰、瘀、毒［9］。总而言之，无非虚实二端，中风之虚主要责之于肝肾阴虚，中风之实主要归咎于瘀血［10］。虽然中风病位在脑髓血脉，但实质上与肝、肾等脏腑有联系，肝肾亏虚是中风病的基本病机。肝肾同源，补肝即补肾，而肾为先天之本，即是补肾法治疗中风病的理论依据。髓海有病，其本在肾，所以治肾亦即治脑［11］。故肾虚血瘀是缺血性中风发病的重要的病理机制之一。有研究表明，补肾方药有显著的脑细胞保护作用，该方以补肾培元立法，佐以活血、化痰、通络、泄毒之品，可以促进急性期患者神经功能的恢复，尤其对起病即有虚证表现的患者效果更加明显［12-13］。故治疗缺血中风在活血化瘀的同时，要补肝生血，补肾生髓，标本兼顾，使精髓旺，血络活，瘀血散，神窍通。根据肝肾同源、从肾治脑、肾脑同治理论遣药组方而成的柔肝通络汤经临床应用证实可明显改善脑卒中患者的神经功能，提高临床疗效，降低致残率，提高生活质量［1-2］。方中制首乌、桑椹、枸杞子滋补肝肾之阴，丹参、当归尾、赤芍活血化瘀，葛根、地龙逐瘀通络，山楂逐瘀化痰，全方共奏益肾生髓、活血通络之功效。

本研究结果显示柔肝通络汤高、中、低量组均能降低神经功能评分，缩小脑梗死面积。笔者发现，在改善脑缺血再灌注后各时间点的神经功能损伤以及缩小脑梗死面积方面，柔肝通络汤高剂量组效果最为显著，提示柔肝通络汤具有对抗脑缺血再灌注损伤的作用，形成脑保护。该方虽在临床取得满意的疗效，实验研究也表明其能有效减少脑缺血再灌注大鼠模型脑梗死面积和神经功能缺损症状，但该方通过何种机制形成脑保护还待进一步研究。

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The Effect of Rougan Tongluo Decoction Pretreated on the MCAO Model of Rats

LONG Huajun，ZHOU Shen，WU Dahua，et al.Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine Research Institute in Hunan Province，Hunan，Changsha 410006，China

Objective：To investigate the effect of Rougan Tongluo Decoction on cerebral ischemia/reperfusion injury in rats.Methods：The experimental rats were divided into high，medium and low dose group and blank control，sham operation group and model group.The Focal cerebral ischemia/reperfusion injury（MCAO）model in rats was made by using suture-occluded method to observe Neurological score at 6h，12h，3h，24h，48h and Cerebral infarct size at 24 h after ischemia reperfusion.Results：Rougan Tongluo Decoction can obviously improve the animal models of neurological symptoms and Reduce infarction area.The Rougan Tongluo Decoction group's neurological deficit score and infarct size were lower than model group（P＜0.05）.Conclusion：Rougan Tongluo Decoction has a protective effect on preventing cerebral ischemia/reperfusion injury in rats.

Rougan Tongluo Decoction；Cerebral ischemia/reperfusion；Cerebral infarct size；Neurological score

R285.5

A

1004-745X（2015）09-1520-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.09.005

2015-04-12）

湖南省中医药科研计划项目（2013110）；湖南省科技计划项目（2014SK3053）