柔肝通络汤对脑缺血再灌注损伤大鼠Bcl-2蛋白表达的影响*

杨 颖 龙华君 刘 雨 帅文昊 张珊珊 胡国恒

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南省中医药研究院附属医院，湖南 长沙 410006；3.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

脑缺血再灌注损伤（CIRI）是指脑组织缺血一段时间后，血流再次恢复，而对缺血区脑组织造成更加严重的损伤，其表现为神经细胞损害和脑功能障碍的进一步加重。研究表明，缺血再灌注损伤的机制与氧化应激反应、炎症因子反应、细胞凋亡和自噬等因素有关，其中B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）作为一种至关重要的内源性神经保护因子，它的表达与脑缺血再灌注损伤神经元的存活有着密不可分的联系［1-2］。陈芬芳等［3］研究证实Bcl-2可以通过多种途径干预细胞凋亡，其表达能影响细胞的存活与灭亡。柔肝通络汤的组成遵循“肝肾同源、从肾治脑、肾脑同治”理论，总结多年的临床经验教训，对临床治疗缺血性脑卒中起到了显著疗效。本研究旨在探讨不同剂量的柔肝通络汤对脑缺血再灌注损伤大鼠Bcl-2蛋白表达的影响，研究柔肝通络汤干预脑缺血再灌注损伤的作用机制，为中医临床方药的应用推广提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用健康雄性Sprague-Dqwley（SD）大鼠78只，体质量250～300 g，鼠龄为18月，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SYXK（湘）2015-0003，饲养于湖南中医药研究院中药研究所SPF级实验室，室温18～20℃，湿度65%～70%，每日喂水喂食。

1.2 试药与仪器

1）药物：柔肝通络汤组方：桑椹15 g，制首乌15 g，枸杞子 30 g，丹参 30 g，当归尾 10 g，赤芍 10 g，山楂15 g，葛根30 g，地龙10 g，均来自湖南中医药研究院附属医院。上述药材煎煮2次，第1次加水量为500 mL，第2次为300 mL，均煎至150 mL；2次煎液去渣滤净后混合，以文火煎至黏稠状（内含生药2 g/mL），冷藏。2）试剂及仪器：MCAO线栓（北京西浓生物科技）；常规生物化学实验试剂（上海国药生物）；中性树胶（美国Sigma）；PBS（谷歌生物）；枸橼酸盐缓冲液、苏木素、伊红（美国Wellbio）；免疫组化二步法试剂盒、DAB试剂盒（北京中杉金桥）；恒温箱（北京六一）；包埋机（武汉俊杰电子）；显微镜（美国Motic）。

1.3 造模及分组

1）动物分组：按照体质量将大鼠进行分层，然后遵循随机数字表法将其分成假手术组（6只大鼠）、模型组（18只大鼠）、柔肝通络汤高剂量组（18只大鼠）、柔肝通络汤中剂量组（18只大鼠）、柔肝通络汤低剂量组（18只大鼠），其中模型组及柔肝通络汤各剂量组再根据脑缺血再灌注后3、12、24 h时间点分3个亚组（每个亚组6只）。2）模型制备：参照改良Longa法将模型组及柔肝通络汤高剂量、柔肝通络汤中剂量、柔肝通络汤低剂量组大鼠制成大脑中动脉堵塞（MCAO）模型，MCAO线栓从大鼠的右侧颈总动脉插入，由颈内外动脉分叉部计（18.5±0.5）mm，插入大脑前动脉，以阻断大脑中动脉血流；假手术组则将栓线插入15 mm以内，不能完全阻断大脑中动脉，其余步骤参照模型组。然后记录阻断时间，缝合伤口，外留线栓10mm，在2 h后轻拔出线栓约10 mm，即再灌注模型建立完成。模型建立成功的3项指标为：（1）提尾时左前肢内收屈曲；（2）同侧Homer征；（3）爬行时向左侧转圈。最后筛除不成功的动物模型。

1.4 干预方法

依照人和动物体表面积换算的等效剂量比率表，柔肝通络汤高剂量、柔肝通络汤中剂量、柔肝通络汤低剂量组分别于造模前7 d灌胃相应剂量的柔肝通络汤汤剂（2.8、1.4、0.7 g/100 g生药含量），假手术组、模型组均用1.4 g/100 g蒸馏水灌胃，均连续预处理灌胃1周，每天1次。末次灌胃给药后30 min，腹腔麻醉处死，将脑组织取出。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 神经功能缺损程度评分 按再灌注3、12、24 h 3个时间点分别进行Longa神经功能缺损程度评分。0分：完全没有神经功能损伤的症状；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：向对侧转圈；3分：向对侧身体倾倒；4分：失去意识，无法自主行走。

1.5.2 梗死侧脑组织观察 将梗死侧脑组织常规固定，石蜡包埋切片，梯度酒精脱水，苏木素染色，水洗，用1%盐酸酒精分化，水洗，伊红染色，水洗，梯度酒精脱水至透明干燥，中性树胶封片，置于显微镜下观察、摄像。

1.5.3 梗死侧脑组织Bcl-2蛋白免疫组化染色（SP法） 将梗死侧脑组织常规固定，石蜡包埋切片，梯度酒精脱水，蒸馏水洗片3 min×2，高温高压条件下抗原修复，切片后加3% H2O2甲醇液，在室温下反应10 min，PBS洗片 3 min×3，甩去，加封闭型动物血清 50 μL，37℃下孵育10 min，甩去，加一抗50 μL，4℃下孵育18 h，PBS洗片5 min×3，甩去，加生物素标记二抗50 μL，37 ℃下孵育10 min，PBS洗片3 min×3，甩去，加链亲和素-过氧化物酶溶液50 μL，37℃下孵育10 min，PBS洗片5 min×3，DAB显色，苏木素轻度复染10 s，常规脱水、透明、封片。采用光学显微镜对梗死侧海马区脑组织进行成像，每张切片选择5个400倍视野范围，并在每个视野范围内对Bcl-2染色阳性细胞进行观察（胞浆或胞核有棕色颗粒者），Image-Pro Plus软件计算出每个视野内的Bcl-2阳性表达细胞的平均光密度（OD值），OD值越大则表明Bcl-2阳性细胞表达越多。

1.6 统计学处理

应用SPSS24.0统计软件。计量资料以（）表示，满足正态分布和方差齐性采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验；若不满足正态分布或方差齐性，采用非参数秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠神经功能缺损程度评分

见表1。假手术组大鼠未表现出明显的神经功能缺损，与假手术组比较，模型组大鼠在不同时间点均表现出明显的肢体神经缺损症状（P＜0.01）。与模型组比较，柔肝通络汤高剂量组大鼠在不同时间点的神经功能缺损程度评分均有显著下降（P＜0.05），柔肝通络汤中、低剂量组不同时间点的神经功能缺损程度评分有所下降，在再灌注3 h时差异明显（P＜0.05）。柔肝通络汤各剂量组间比较，同一时间点，神经功能缺损程度评分随柔肝通络汤剂量的降低而逐渐升高，柔肝通络汤高剂量组评分最低，柔肝通络汤低剂量组评分最高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组与柔肝通络汤高、中、低剂量组的神经功能缺损程度评分在脑缺血再灌注3 h时最低，12 h时上升，24 h时最高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠不同时间点的神经功能缺损程度评分比较（分，±s）

表1 各组大鼠不同时间点的神经功能缺损程度评分比较（分，±s）

注：与模型组同时期比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与假手术组同时期比较，#P＜0.05。下同。

组别假手术组模型组柔肝通络汤高剂量组柔肝通络汤中剂量组柔肝通络汤低剂量组n 6 6 6 6 6再灌注3 h 0 2.00±0.63#1.17±0.43*1.33±0.52*1.33±0.63*再灌注12 h 0 2.33±0.52#1.50±0.55*1.88±0.25 2.00±0.41再灌注24 h 0 2.80±0.41#2.00±0.63*2.33±0.52 2.42±0.55

2.2 各组大鼠梗死侧脑组织观察

图1 各组大鼠不同时间点海马区脑组织观察（HE染色，400倍）

见图1。假手术组：正常细胞层次明了，结构完好，细胞胞浆和胞核染色均匀，细胞核位于中间位置，核仁清晰可见。模型组：较假手术组而言，正常细胞数量减少，神经元变性、坏死加重，细胞形态各异，胞体变小，胞核固缩深染，核仁不易见；细胞间隙扩大，大量空泡样改变，血管扩张充血明显。细胞损伤程度以再灌注3 h时为轻，随着时间的推移，细胞损伤逐步加重，在24 h时最为严重。较模型组相比，柔肝通络汤各组的神经细胞损伤情况得以减轻，其中柔肝通络汤高剂量组大鼠的神经元细胞形态较为完整，正常细胞数量较多，细胞固缩程度较轻，仍能清晰区分胞膜和核仁，细胞空泡样改变较少。而柔肝通络汤中、低剂量组大鼠脑组织损伤程度较柔肝通络汤高剂量组有所加重，以柔肝通络汤低剂量组最为严重。柔肝通络汤各剂量组大鼠在再灌注3 h时细胞损伤程度最轻，随着时间的推移，神经元细胞变性、坏死逐渐加重，24 h时最为严重。

2.3 各组大鼠梗死侧脑组织Bcl-2阳性细胞表达比较

见表2。假手术组大鼠梗死侧海马区的Bcl-2表达最少，而模型组和柔肝通络汤高、中、低剂量组均有Bcl-2蛋白的散在分布。模型组的Bcl-2蛋白表达明显高于假手术组（P＜0.01）。与模型组比较，柔肝通络汤高、中、低剂量组Bcl-2蛋白在各时间点的表达均显著增高（P＜0.01），且随柔肝通络汤剂量的增加而增加，柔肝通络汤高剂量组中Bcl-2表达最高，柔肝通络汤低剂量组中Bcl-2表达最低。缺血再灌注3 h时，各组大鼠的Bcl-2表达最少，随着时间的推移，12 h时有所增加，24 h时达到最高值，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠不同时间点的Bcl-2阳性细胞表达比较（OD值，±s）

表2 各组大鼠不同时间点的Bcl-2阳性细胞表达比较（OD值，±s）

组别假手术组模型组柔肝通络汤高剂量组柔肝通络汤中剂量组柔肝通络汤低剂量组n 6 6 6 6 6再灌注3 h-0.036±0.010#0.111±0.004**0.102±0.005**0.070±0.007**再灌注12 h 0.008±0.004 0.054±0.010#0.126±0.006**0.111±0.006**0.090±0.006**再灌注24 h-0.082±0.006#0.127±0.007**0.117±0.004**0.103±0.006**

3 讨论

脑缺血再灌注损伤的机制与能量代谢失衡、兴奋性毒性、炎症因子释放、自由基损伤、细胞内Ca2+超载、凋亡相关基因激活等因素有关［4-6］，这些病理过程又相互作用、互为因果，最终造成细胞死亡［7］。例如，脑组织缺血缺氧后，生成过量的氧自由基，直接诱导神经元细胞凋亡；能量代谢失衡和钙离子超载都可由线粒体损伤引起，而这些又会促进细胞的凋亡；缺血缺氧可能激活凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、Caspase-3等）的表达，进而影响凋亡机制的进展。研究表明，Bcl-2蛋白作为至关重要的抗凋亡蛋白，可影响脑缺血再灌注损伤后部分神经细胞的存活［8］，它的特点是其三维空间结构所形成的疏水凹槽除了能结合含有BH3结构域的促凋亡蛋白影响细胞凋亡外，还能通过多种机制调控氧化应激，从其他途径诱导细胞凋亡；此外，定位于神经细胞内质网上的Bcl-2可调节细胞内钙离子的稳定状态，促进钙离子的快速释放，从而诱导细胞凋亡［9］。但又有实验研究表明［10］，在缺血再灌注损伤的早期治疗阶段，有效运用转基因技术、病毒载体、针灸疗法和神经保护制剂等积极的治疗方法，可以提高Bcl-2蛋白的表达，从而抑制凋亡的活化，促进脑组织神经元修复。近年来，关于中医药抑制细胞凋亡的研究日益增多，如银杏叶提取物［11］对脑缺血再灌注损伤发挥神经保护作用，其机制可能与提高脑组织中Bcl-2的表达，降低脑组织中Bax的表达有关；灯盏花素［12］对脑缺血再灌注损伤后的细胞凋亡起到了抑制作用，其减轻脑损伤的作用可能与增加c-Bcl-2表达，减少c-fos和Caspase3的表达有关；丹参［13］对脑缺血后脑组织具有神经保护作用，其机制可能与减少脑缺血后ICE的表达，增加Bcl-2的表达有关；补阳还五汤［14-15］能显著减少缺血再灌注后神经细胞凋亡，减少脑梗死面积，其影响因素可能与增加Bcl-2/Bax比值有关。

本实验研究结果显示，模型组大鼠在脑缺血再灌注损伤后的神经功能缺损程度评分明显高于假手术组（P＜0.01），且神经元细胞损伤更为明显，其损伤程度随时间的推移而持续加重。柔肝通络汤各剂量组大鼠的神经功能缺损程度评分明显低于模型组（P＜0.05），均能明显减轻神经元细胞损伤，其改善程度呈剂量依赖关系，其中柔肝通络汤高剂量的治疗效果最明显，说明柔肝通络汤能有效缓解大鼠脑缺血再灌注脑损伤，降低肢体神经功能缺损程度。在Bcl-2蛋白表达方面，模型组高于假手术组（P＜0.01），其中再灌注3 h时Bcl-2蛋白表达较少，且Bcl-2蛋白表达随时间的推移持续增加，24 h时达到最高，说明脑缺血再灌注损伤可持续激活抗凋亡基因Bcl-2蛋白。柔肝通络汤高、中、低剂量组与模型组相比，各时间点的Bcl-2表达均明显升高（P＜0.01），且随着柔肝通络汤剂量的增加而增加，说明不同剂量的柔肝通络汤均能上调Bcl-2蛋白的表达。

中医学认为缺血性脑卒中的病位在脑髓血脉，而脑髓因肾而生，髓海之病，其本源在肾，当以补肾为主；乙癸同源，精血互生，阴血亏虚首责为肝肾亏虚；髓海血脉为病，脉络不畅，气血停滞，瘀血内生，而脑髓不得濡养，故其病机关键为阴虚血瘀，因此治疗缺血性中风应当以养肝补肾为主，兼以活血通络。柔肝通络汤方中以桑椹子为君，入心、肝、肾经，滋阴补血；制首乌补益精血，枸杞子滋补肝肾，共为臣药，助君补肝肾之阴；赤芍、丹参、当归尾等皆入肝经而活血散瘀力强，葛根味辛能行以助活血化瘀，地龙善走窜可通经活络，山楂通行气血，和胃助运，共为佐药。临床应用［16］已证明柔肝通络汤能有效改善患者神经功能缺损，缩短康复时间，提高临床疗效。本课题组前期基础研究［17-18］也证实本方能降低MCAO大鼠神经功能缺损程度评分，缩减脑梗死面积，降低凋亡细胞数，增加活神经元数。本研究提示柔肝通络汤能使脑缺血再灌注损伤后大鼠Bcl-2蛋白表达明显升高，神经功能缺损程度评分明显降低，脑组织神经细胞损伤明显减轻，说明该方具有脑神经保护的作用。然而，由于Bcl-2蛋白生物学特性的复杂性和参与机制的多样性，柔肝通络汤对抗凋亡蛋白Bc1-2的调控作用及其信号传导途径尚待进一步研究。