健脾解毒汤对脾虚湿盛证银屑病样大鼠皮肤屏障功能调控机制研究

左永杰,许孟月,李 斌,祖丽娅·吐尔地, 姚文汇,刘红霞

(1. 新疆医科大学第四临床医学院,新疆 乌鲁木齐 830000;2. 新疆医科大学附属中医医院,新疆 乌鲁木齐 830000)

银屑病是一种遗传与环境共同作用诱发、免疫介导的慢性、复发性、炎症性、系统性疾病,与易感基因、皮肤屏障损伤和免疫异常等有关,临床上表现为边界清楚的红斑、丘疹和斑块,上覆银白色鳞屑[1-2]。皮肤屏障损伤后,表皮细胞过度增殖、角化不全以及真皮层的淋巴细胞浸润会进一步损害皮肤屏障功能,使得肌肤失养,病情加重、反复[3]。目前研究认为水通道蛋白3(AQP3)与银屑病发病密切相关,银屑病皮损组织中AQP3表达减少,促使患者皮肤处于缺水状态,皮肤表现为干燥失养,皮肤屏障功能下降[4]。首届岐黄学者刘红霞教授结合新疆的气候、饮食及证候特点,提出“健脾祛湿法”治疗银屑病的学术思想[5-6],以法类方的“健脾解毒汤”治疗银屑病取得良好的临床疗效。团队前期研究发现,健脾解毒汤可以促进脾虚湿盛证银屑病小鼠表皮颗粒层细胞分化,抑制其有丝分裂[7-8];可改善银屑病皮损,缓解“肌肤甲错”症状,其作用机制可能与调节T淋巴细胞亚群、JAKs/STATs通路及炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-17(IL-17)水平有关[9-10]。本研究基于皮肤屏障功能,探讨了健脾解毒汤是否通过细胞外信号调节激酶/p38丝裂原活化蛋白激酶(ERK/p38MAPK) 信号通路调控脾虚湿盛证银屑病大鼠皮肤组织AQP3的表达而发挥治疗作用,以进一步明确其作用机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性SD大鼠144只,6～8周龄,体重180～200 g,由新疆医科大学动物饲养中心提供,动物合格证号:SYXK(新)2018-0001。采用新疆医科大学动物饲养中心提供的标准颗粒饲料常规分笼饲养,饲养温度(23±3)℃,相对湿度40%～70%,自然光照,实验前适应性饲养1周。

1.2主要药物 健脾解毒汤,由土茯苓30 g、绵萆薢10 g、黄柏10 g、苦参10 g、连翘30 g、生薏苡仁30 g、茯苓10 g、炒白术10 g、白花蛇舌草30 g、丹参10 g、炙甘草6 g组成,水煎剂由新疆医科大学第四附属医院制剂室提供。大黄配方颗粒剂,江阴天江药业有限公司,3 g/袋。咪喹莫特乳膏,四川明欣药业有限责任公司生产,国药准字H20030128。

1.3主要试剂及仪器 p38MAPK抑制剂(SB203580,美国MCE公司,批号:HY-10256)、ERK1/2通路抑制剂(U0126,美国MCE公司,批号:HY-12031);苏木素染液(福州迈新生物技术开发有限公司,批号:CTS-1097);伊红染液、中性树胶(北京中杉金桥生物技术有限公司,批号分别为ZLI-9613、ZLI-9555);RIPA裂解液(博士德生物,批号:AR0105);蛋白酶抑制剂(博士德生物,批号:AR1178);山羊抗兔IgG H&L(HRP,Abcam,批号:ab205718);山羊抗小鼠IgG H&L(HRP,Abcam,批号:ab205719);PVDF Transfer Membrane(0.45 μm)(Millipore,批号:IPVH00010);SuperSignalTMWest Pico PLUS Chemiluminescent Substrate(Thermo Fisher,批号:34580);beta-Actin Loading Control antibody Mouse MAb(义翘神州,批号:100166-MM10);Anti-Aquaporin3抗体、Anti-ERK1 + ERK2抗体、Anti-ERK1(phospho T202)+ ERK2 (phospho T185)抗体、Anti-p38 alpha/MAPK14抗体、Anti-p38(phospho T180 + Y182)抗体(abcam,批号依次为ab125219、ab184699、ab201015、ab170099、ab4822)。手动单道移液器(德国Eppendorf公司,批号:Research plus);电子天平(Germany Sartorius,批号:CP324S);台式低速离心机(上海飞鸽仪器有限公司 ,批号:TGL-16GB);酶标仪(美国Bio-Rad xMarkTM);凝胶成像系统(上海天能2500)。

1.4实验方法 将雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组、甲氨蝶呤组、健脾解毒汤低剂量组、健脾解毒汤中剂量组、健脾解毒汤高剂量组、健脾解毒汤低剂量+ERK抑制剂组、健脾解毒汤中剂量+ERK抑制剂组、健脾解毒汤高剂量+ERK抑制剂组、健脾解毒汤低剂量+MAPK抑制剂组、健脾解毒汤中剂量+MAPK抑制剂组、健脾解毒汤高剂量+MAPK抑制剂组,每组12只。除空白组外,其余组大鼠先参考文献[11]方法建立银屑病样皮损模型:大鼠背部备皮,范围3 cm×3 cm,将5%咪喹莫特62.5 mg局部涂抹于背部剃光的皮肤处,连续涂抹10 d;然后依据“苦寒之药损其脾胃”观点,参考文献[7]建立脾虚湿盛证模型:1 g/mL大黄配方颗粒剂 10 mL/(kg·次)灌胃,2次/d,连续10 d。造模结束后,按照《中药药理研究方法学》[12]中由人和动物的体表面积计算法计算出的给药剂量,甲氨蝶呤组给予甲氨碟呤片0.97 mg/kg灌胃;健脾解毒汤低、中、高剂量组分别给予2.32 g/kg、4.64 g/kg、9.26 g/kg 健脾解毒汤灌胃;健脾解毒汤低、中、高剂量+ERK抑制剂各组均给予20 μg的U0126腹腔注射,同时给予相应剂量的健脾解毒汤灌胃;健脾解毒汤低、中、高剂量+MAPK抑制剂各组均给予3 mg/kg的SB203580腹腔注射,同时给予相应剂量的健脾解毒汤灌胃;空白组和模型组给予等量的生理盐水灌胃和腹腔注射。灌胃和腹腔注射均1次/d,连续14 d。

1.5检测指标及方法

1.5.1皮肤状态 观察各组大鼠背部皮肤状态并拍照。

1.5.2皮肤组织病理形态 末次灌胃结束后处死各组大鼠,收集背部皮损组织,用固定液固定组织标本,常规石蜡包埋、切片,HE染色后在光镜下观察皮损组织病理形态。

1.5.3皮损组织中AQP3、ERK1/2、p-ERK1/2、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达情况 采用Western blot法检测:取出保存在液氮中的皮肤组织,经液氮研磨后,将约150 mg皮肤组织加入到预冷的1.5 mL离心管中,然后加入300 μL RIPA裂解液,充分混匀,4 ℃放置60 min后,4 ℃下12 000 r/min离心15 min,收集上清液。采用BCA法测定蛋白浓度,进行电泳、转膜,5%脱脂奶粉封闭,加入AQP3(1∶1000)、ERK1+2(1∶1 000)、p-ERK1+2(1∶600)、p38MAPK(1∶1 000)、p-p38 MAPK(1∶800)、β-actin(1∶1 000)一抗,4 ℃孵育过夜,加入二抗,室温下孵育1 h,ECL法显色,以β-actin为内参蛋白,运用凝胶成像系统分析灰度值,计算空白组、模型组、甲氨蝶呤组、健脾解毒汤低剂量组、健脾解毒汤中剂量组、健脾解毒汤高剂量组、健脾解毒汤高剂量+ERK抑制剂组、健脾解毒汤高剂量+MAPK抑制剂组各目的蛋白相对表达量。

1.6统计学方法 运用SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析,计量资料多组比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组大鼠灌胃结束后背部皮肤状态 空白组大鼠背部皮肤未见红斑鳞屑;模型组大鼠背部皮肤可见紫红色斑块,表皮肥厚隆起,较厚鳞屑;甲氨蝶呤组和健脾解毒汤低、中、高剂量组大鼠背部皮肤可见淡红色斑块,细碎鳞屑;健脾解毒汤低剂量+ERK抑制剂组、健脾解毒汤中剂量+ERK抑制剂组、健脾解毒汤低剂量+MAPK抑制剂组、健脾解毒汤中剂量+MAPK抑制剂组大鼠背部皮肤可见深红色斑块,表皮微隆起,片状鳞屑;健脾解毒汤高剂量+ERK抑制剂组、健脾解毒汤高剂量+MAPK抑制剂组大鼠背部皮肤可见淡红斑,无明显鳞屑,皮损与正常平齐。见图1。

2.2各组大鼠皮肤组织病理学形态 空白组表皮未见明显增生,角质层较薄,表皮突平坦,真皮层内少量慢性炎细胞浸润,无明显血管扩张;模型组表皮增生肥厚,显著角化不全伴角化过度,表皮突延长,部分表皮细胞间水肿,表皮内及角质层内较多中性粒细胞浸润,真皮浅层内血管扩张,慢性炎细胞散在或灶状浸润;与模型组比较,各药物组皮肤组织病变程度均减轻,健脾解毒汤高剂量组、健脾解毒汤高剂量+ERK抑制剂组、健脾解毒汤高剂量+MAPK抑制剂组的皮肤组织病变程度均显著减轻,且健脾解毒汤高剂量+ERK抑制剂组、健脾解毒汤高剂量+MAPK抑制剂组病变程度稍轻于健脾解毒汤高剂量组。见图2。

2.3各组大鼠皮肤组织中AQP3、ERK/P38 MAPK信号通路相关蛋白表达情况 与空白组比较,模型组AQP3蛋白相对表达量明显降低(P均<0.05),p-ERK1/2、p-p38 MAPK蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05);与模型组比较,甲氨蝶呤组、健脾解毒汤低剂量组、健脾解毒汤中剂量组、健脾解毒汤高剂量组、健脾解毒汤高剂量+ERK抑制剂组、健脾解毒汤高剂量+MAPK抑制剂组AQP3蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),p-ERK1/2、p-p38 MAPK蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05);且健脾解毒汤高剂量+ERK抑制剂组、健脾解毒汤高剂量+MAPK抑制剂组AQP3蛋白相对表达量均明显高于其他药物组(P均<0.05),健脾解毒汤高剂量+ERK抑制剂组、健脾解毒汤高剂量+MAPK抑制剂组p-p38 MAPK蛋白相对表达量均明显低于其他药物组(P均<0.05),健脾解毒汤高剂量组、健脾解毒汤高剂量+ERK抑制剂组、健脾解毒汤高剂量+MAPK抑制剂组p-ERK1/2蛋白相对表达量均明显低于甲氨蝶呤组、健脾解毒汤低剂量组、健脾解毒汤中剂量组(P均<0.05),且健脾解毒汤高剂量+ERK抑制剂组p-ERK1/2蛋白相对表达量均明显低于健脾解毒汤高剂量+MAPK抑制剂组和健脾解毒汤高剂量组(P均<0.05)。见图3及图4。

3 讨 论

健脾解毒汤是刘红霞教授临证多年治疗银屑病的经验方,方中土茯苓、萆薢为君,共同发挥祛湿解毒通络之功;白术、茯苓、薏苡仁为臣,三药相使为用,一燥一渗,运利结合,使水湿除而脾气健;白花蛇舌草、连翘、黄柏、苦参及丹参为佐药,合用共奏清热解毒、燥湿止痒之功;甘草药性平和,通行十二经脉,可解毒、补虚、调和诸药,为使药;全方配伍刚柔相济,散收同施,共奏健脾解毒、润燥止痒之效,且健脾益气除湿而不伤津。既往临床研究表明,健脾解毒汤可有效治疗脾虚湿盛证寻常型银屑病[9,13]。

银屑病发病机制复杂,近年来研究发现角质形成细胞异常增生和分化、皮肤屏障功能受损刺激炎症因子释放等皮肤屏障功能失调因素均参与了银屑病的发生发展,其中各种表皮结构蛋白如AQP3作为维持皮肤屏障功能的主要生化结构与银屑病的发生发展关系密切[14]。本实验结果表明,脾虚湿盛证银屑病样大鼠皮肤组织出现明显病理改变,皮肤组织中AQP3蛋白呈现异常低表达;不同剂量健脾解毒汤干预后,大鼠皮肤病变程度均减轻,皮肤组织中AQP3蛋白表达量明显上调,且健脾解毒汤高剂量组改善更明显。提示健脾解毒汤改善脾虚湿盛证银屑病样大鼠皮肤组织屏障功能的作用与上调皮肤组织中水通道蛋白的表达有关。

图1 空白组和银屑病各组大鼠灌胃结束后取样前背部皮肤表现

MAPK信号通路是细胞中炎症反应的关键通路,具有将细胞外的刺激信号转导至细胞内,并引起细胞应激、分化、增殖、凋亡的作用[15]。ERK1/2、p38MAPK是MAPK信号通路的重要成员,分别具有调控细胞生长与分化和调节炎症与细胞凋亡等应激反应的作用[16]。有研究表明,AQP的表达与MAPK信号通路的激活密切相关[17-18]。本实验结果发现,脾虚湿盛证银屑病样大鼠皮肤组织中p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白异常高表达,不同剂量健脾解毒汤干预可不同程度地下调p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白表达,其中高剂量健脾解毒汤干预后p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白下调更明显。而高剂量健脾解毒汤分别与p38MAPK抑制剂和ERK1/2通路抑制剂联合作用后,p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白表达进一步下调,AQP3蛋白表达进一步上调,提示ERK/p38MAPK信号通路参与了健脾解毒汤对脾虚湿盛证银屑病样大鼠皮肤组织AQP3表达的调节作用。

综上所述,脾虚湿盛证银屑病样大鼠出现明显皮肤屏障功能异常,健脾解毒汤能够通过抑制ERK/p38 MAPK信号通路的激活而上调脾虚湿盛证银屑病样大鼠皮肤组织中AQP3蛋白表达,促进皮肤的水合作用,从而改善皮肤的干燥程度,修复皮肤的屏障功能。本实验进一步验证了健脾方药具有修复皮肤屏障功能的作用,但由于中药具有多组分、多通路、多靶点作用等特点,仍需对其有效成分及作用机制进行深入研究。

图2 空白组和银屑病各组大鼠皮肤组织病理学形态(HE染色)

图3 空白组和银屑病各组大鼠皮肤组织中AQP3、ERK1/2、p-ERK1/2、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白印迹图

图4 空白组和银屑病各组大鼠皮肤组织中AQP3、ERK1/2、p-ERK1/2、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白相对表达量

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。