保肝汤对小鼠四氯化碳致慢性化学性肝损伤的保护作用*

李谚语，刘 丽，范 颖，李 军，张英利，卢 健

（辽宁中医药大学，沈阳 110847）

肝脏是人体主要的代谢器官，肝损伤常见的原因有病毒感染、创伤、及化学中毒等[1]。据统计，全世界每年10万人中约有13．9～24．0人发生药物性肝损[2]。因此寻求抗肝损伤，抗肝纤维化的药物日益受到关注。保肝汤由黄芪、葛根、枸杞子、五味子等组成，具有疏肝理气、清热解毒的功效。本研究旨在分析中药保肝汤对四氯化碳（CCl4）致慢性化学性肝损伤小鼠的肝脏保护作用。

1 材料

1.1 实验动物 SPF级昆明种小鼠84只，雄性，体质量20～25 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2012-0001。

1.2 实验药物 保肝汤：由黄芪、葛根、枸杞子、五味子等组成（饮片购自辽宁中医药大学附属医院）。用10倍蒸馏水浸泡上述饮片30min，煎煮1h，过滤，取滤液；再加8倍蒸馏水于药渣，煎煮40 min，过滤，取滤液；合并两次煎煮滤液，浓缩，分别配置高、中、低剂量灌胃药液，备用。其中高、中、低剂量组灌胃药液浓度分别为含生药 0．024 g/mL、0．012 g/mL、0．006 g/mL。护肝片：由柴胡、茵陈蒿、板蓝根、绿豆、五味子、猪胆粉组成（批号：201405080，购自黑龙江葵花药业股份有限公司）。将护肝片配制成浓度为含生药0．006 g/mL的溶液，备用。

1.3 主要试剂 丙氨酸转氨酶（ALT）测试盒（1113051，南京建成生物工程研究所）；天冬氨酸转氨酶（AST）测试盒（CH0105202，南京建成生物工程研究所）；丙二醛（MDA）测试盒（20140530，南京建成生物工程研究所）；超氧化物歧化酶（SOD）测试盒（20140529，南京建成生物工程研究所）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号：201404，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；甘油三酯（TG）测试盒（批号：1213061，南京建成生物工程研究所）。

1.4 主要仪器与设备 电子天平（ALC-210．3，赛多利斯科学仪器）；台式高速大容量冷冻离心机（TGL20M-Ⅱ，湖南省凯达实业以展）；台式高速冷冻离心机（Neofuge 13R，上海力申科学仪器）；全自动生化仪（TBA-40FR，日本东芝）；-80℃冰箱（DWHL38，中科美菱）；电热恒温培养箱（SHA-C，常州国华电器）。

2 实验方法

2.1 分组方法 将84只昆明小鼠随机分为6组，即正常组、模型组、护肝片组、保肝汤高剂量组、保肝汤中剂量组、保肝汤低剂量组，每组14只。

2.2 造模与给药方法 适应性喂养1周后，除正常组外，其余各组分别在实验第 1、3、10、16、22、25、28天腹腔注射0.5%CCl4；于造模后第10天开始灌胃，其中正常组和模型组给予蒸馏水（0.01 mL/g）灌胃，护肝片（0.5 g/kg）及保肝汤高剂量组（32 g/kg）、保肝汤中剂量组（16 g/kg）、保肝汤低剂量组（8 g/kg）分别给予灌胃药液。第30天灌胃2 h后称质量，腹主动脉取血，于肝左、右中叶、尾状叶各取材1块，置于4%多聚甲醛溶液中固定，待测病理；将取材后的肝脏以冷生理盐水冲洗后，置低温冰箱保存，待测指标。

2.3 病理组织学检测及肝脏指数计算 病理组织学检测：取4%多聚甲醛溶液中固定的肝组织用石蜡包埋、切片、苏木精-伊红（HE）染色，光镜下观察。

计算肝指数：肝脏指数＝肝脏质量/进食体质量[3]。

2.4 指标测定 采用基于IFCC2002配方法检测血清ALT、AST的活性；采用抽提法测定SOD，采用TBA法测定MDA含量；严格按试剂盒操作。

2.5 数据处理 采用SPSS 19.0统计软件进行分析，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 对肝组织病理的影响 在光学显微镜下观察，模型组中央静脉和肝细胞形态、结构变形明显，肝细胞肿胀，细胞核变大，肝细胞界限不清，有的部位核仁消失，可见多处大片肝细胞脂肪变性，并见多处灶状坏死。表明实验造模成功。保肝汤各剂量组与模型组比较在肝组织形态及结构上均有所改善，中、低剂量组肝组织镜下改变明显肝组织形态结构接近正常，散见肝细胞脂肪变性。见图1。

3.2 对肝指数的影响 与正常组相比，模型组及保肝汤高、中、低剂量组肝指数升高明显（P＜0.05）；与模型组比较，保肝汤无统计学差异（P＞0.05）。见表1。

3.3 保肝汤对实验小鼠血清ALT、AST、AST/ALT的影响

3.3.1 对ALT的影响 与正常组比较，模型组ALT明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，保肝汤高、中、低剂量组ALT均明显降低（P＜0.05）。保肝汤中剂量组比低剂量组明显降低（P＜0.05）。见表 2。

3.3.2 对AST的影响 与正常组比较，模型组AST显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，保肝汤中剂量组AST明显降低（P＜0.05）；保肝汤中剂量组AST值低于保肝汤低剂量组（P＜0.05）。见表2。

图1 保肝汤对小鼠肝组织形态的影响（肝组织HE,×400）Fig.1 Effect of Baogan Decoction on the morphology of liver tissueof mice(HE,×400 of liver tissue)

表1 对肝指数的影响（s）Tab.1 Influenceon liver index（±s）

表1 对肝指数的影响（s）Tab.1 Influenceon liver index（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05。

组别 动物数 肝指数（%）正常组 14 4.10±0.33模型组 12 4.56±0.48*护肝片 13 4.50±0.66保肝汤高剂量组 13 4.68±0.52保肝汤中剂量组 12 4.74±0.46保肝汤低剂量组 13 4.49±0.59

3.3.3 对AST/ALT的影响 与模型组比较，保肝汤高、中、低剂量组均显著升高（P＜0.05）。见表2。

3.4 保肝汤对实验小鼠血清SOD、MDA、TG的影响

3.4.1 对SOD的影响 与模型组比较，保肝汤高、中、低剂量组SOD值均有升高趋势，但无统计学意义（P＞0．05）。保肝汤中剂量组与正常组比较显著升高（P＜0.05）。见表 3。

表 2 对 ALT、AST、AST/ALT 的影响（±s）Tab.2 Influenceon ALT、AST、AST/ALT（±s）

表 2 对 ALT、AST、AST/ALT 的影响（±s）Tab.2 Influenceon ALT、AST、AST/ALT（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与中剂量组比较，#P＜0.05。

组别 动物数 ALT(U/L) AST(U/L) AST/ALT正常组 14 42.08±7.66 81.69±12.78 1.98±0.35模型组 12 54.23±12.57* 125.77±30.04* 2.52±1.35护肝片 13 37.40±6.70 100.40±21.33 2.72±0.57Δ保肝汤高剂量组 13 36.71±13.32△ 110.64±28.22 3.37±1.76△保肝汤中剂量组 12 34.71±6.26△ 97.50±21.63△ 2.87±0.66△保肝汤低剂量组 13 43.00±17.89△# 120.73±33.56# 3.01±0.85△

3.4.2 对MDA的影响 与正常组比较，模型组MAD值明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，保肝汤中剂量组和低剂量组显著降低（P＜0．05）。保肝汤高剂量组和中剂量组比较显著升高（P＜0．05）。见表3。

3.4.3 对TG的影响 与模型组比较，保肝汤高剂量组和低剂量组显著升高（P＜0．05）。保肝汤低剂量组TG值明显高于保肝汤中剂量组（P＜0．05）。见表3。

表 3 对 SOD、MDA、TG 的影响（±s）Tab.3 Influence on SOD、MDA、TG（±s）

表 3 对 SOD、MDA、TG 的影响（±s）Tab.3 Influence on SOD、MDA、TG（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与保肝汤中剂量组比较，#P＜0.05。

组别 动物数 SOD（U/mg） MDA（nmol/mL） TG（mmol/L）正常组 14 258.86±91.45 0.42±0.06 1.39±0.40模型组 12 272.88±25.49 0.57±0.03* 1.09±0.31护肝片 13 261.56±43.56 0.51±0.08 1.22±0.42保肝汤高剂量组 13 272.96±51.33 0.55±0.06# 1.59±0.39Δ保肝汤中剂量组 12 307.97±44.42 0.44±0.09Δ 1.30±0.30保肝汤低剂量组 13 290.25±38.67 0.48±0.07Δ 1.67±0.49△#

4 讨论

CCl4是化学性肝毒剂，腹腔注射能引起实验动物膜通透性增加，细胞内的酶释放，其分子中的三氯甲基基团经催化后形成三氯甲基过氧化基团，引起了肝细胞脂质过氧化反应，进而导致肝脏损伤及肝功能异常[4-5]。本实验通过复制CCl4致慢性化学性肝损伤模型，研究保肝汤对CCl4致慢性化学性肝损伤的保护作用。

ALT和AST是反映肝损伤程度的指标[6]，其中ALT是最常用的判断肝细胞是否受损的敏感指标；AST大幅度升高意味着肝细胞损伤的程度比较严重[7]。AST/ALT比值增大，说明肝细胞损伤程度严重且认为是慢性化程度加重的标志[8]。本研究中，保肝汤高、中、低剂量组ALT水平较模型组明显降低。保肝汤高、中、低剂量组AST水平均较模型组降低，其中保肝汤中剂量组最低。保肝汤高、中、低剂量组AST／ALT值较模型组均升高。结果表明保肝汤对小鼠肝损伤有一定保护作用；保肝汤中剂量降低肝细胞的损伤程度在保肝汤3组中效果最好；在肝损伤慢性化程度进展上保肝汤各剂量组均无明显作用。

SOD是一种抗氧化酶，SOD的活性可以反映自由基的清除率。MDA是脂质过氧化的主要产物，间接反应肝损伤程度[9-11]。TG在肝脏、脂肪等组织中进行合成，肝脏也将血液中的糖类转化为TG。本研究中，模型组SOD稍升高，和空白组比较无统计学差异，这与其他实验研究趋势不同[12-13]，考虑是CCl4进入机体后激活了机体的氧化应激信号通路，引起SOD应激性升高。实验结果显示，保肝汤中剂量组SOD明显升高，MDA值最低，可见，保肝汤中剂量组的脂质过氧化产物最少，脂质过氧化程度最轻，对清除自由基、抑制自由基启动脂质过氧化反应效果最好。此外，保肝汤高剂量组和低剂量组与模型组比较TG值显著升高，说明保肝汤高、低剂量组对肝脏的作用倾向于提高肝脏对TG的合成。

由此可见，保肝汤能够减轻CCl4对小鼠肝细胞的损伤程度，并具有一定的保肝作用，其中，以保肝汤中剂量组作用最优；作用机制与抑制肝损伤后脂质过氧化反应有关。