四磨汤通过调控NF-κB信号通路改善重度脓毒症大鼠结肠上皮细胞屏障功能障碍炎症状态作用研究

温剑艺,王首红,刘艳红,张崇健,郭伟新

(广东省人民医院 广东省医学科学院,广东 广州 510080)

脓毒症是重症患者死亡的重要原因之一[1]。研究显示[2]肠道组织是脓毒症早期受累以及重度脓毒症发生、发展的靶器官之一,而肠道上皮细胞屏障功能障碍是多器官以及组织衰竭的“始动”因子。Guo等[3]研究显示在脓毒症小鼠模型中,核转录因子κB(NF-κB)信号被激活,磷酸化NF-κB65 (NF-κB p65)的表达明显升高,动物血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)等水平明显升高,炎症性应激加剧,患者肠道组织的免疫屏障标志物白细胞共同抗原(CD45)以及肠道上皮细胞机械屏障的标志物闭合蛋白1(Claudin-1)和闭锁蛋白1(ZO-1)的表达明显下降,动物结肠组织的病理损伤明显加重。Xie等[4]研究指出,在脓毒症患者中,炎症性应激的晚期介质高迁移率蛋白-1(HMGB1)以及核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)伴随NF-κB p65的表达骤增是脓毒症趋于恶性进展的标志性事件。四磨汤出自《济生方》,主要由木香、枳壳、乌药、槟榔四味中药组成,在临床上被称作“胃肠动力剂”[5]。本研究以盲肠结扎穿孔术(CLP)模拟脓毒症状态,构建大鼠重度脓毒症模型,从NF-κB信号入手,以NF-κB信号通路激活剂佛波酯(PMA)进行功能挽救实验,探讨四磨汤对重度脓毒症大鼠结肠黏膜的保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:SD大鼠,雄性,SPF级,50只,7～8周龄,体重220～250 g,购自广东莱迪生物医药研究院有限公司,生产批号:SCXK(粤)2022-0064。在我院SPF级基础动物房中,设定温度(25±2)℃,湿度(45±5)%,12 h/12 h交替光暗周期的饲养条件下进行适应性喂养1周后用于实验。

1.1.2 实验试剂:NF-κB信号通路激活剂(PMA,美国Selleck公司),四磨汤口服液 (主要成分有木香、枳壳、乌药、槟榔,湖南汉森制药股份有限公司,规格:10 ml,国药准字 Z20025044),多聚甲醛、二甲苯、无水乙醇等(武汉华美生物技术有限公司),兔抗大鼠NF-κB、兔抗大鼠NF-κB p65、兔抗大鼠三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体、兔抗大鼠B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、兔抗大鼠Bcl-2相关X蛋白(Bax)单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司),苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(武汉凯基生物技术公司),末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的脱氧尿苷三磷酸(dUTP)缺口末端标记(TUNEL)(北京中杉生物公司),免疫组化、免疫荧光、蛋白质免疫印迹(Western blot)试剂盒(美国Bio-Rad公司),酶联吸附试剂盒(上海生工生物工程技术有限公司)。

1.1.3 实验仪器:超低温冰箱(日本三洋公司),DYCP-31CN型琼脂糖水平电泳仪以及凝胶成像系统(北京六一仪器厂),REBEL 2 IN 1正置/倒置Hybrid显微镜(美国Discover ECHO公司),Multiskan SkyHigh Microplate Spectrophotometer 酶标仪(美国赛默飞公司),Tundra 冷冻透射电子显微镜(Cryo-TEM) (荷兰赛默飞世尔科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠重度脓毒症模型建立:根据Bi等[6]介绍的方法通过CLP术构建动物模型,腹腔注射45 mg/kg的戊巴比妥钠将动物麻醉,无菌操作台上,以仰卧位进行固定后,腹部备皮,沿腹正中线剪开约1 cm切口,移出腹腔中的盲肠,结扎其根部,在显微镜下,刺穿盲肠,挤压盲肠,排出肠内容物后,逐层关腹。

造模术后4 h,对实验动物从毛发竖立、腹泻、结膜炎以及昏睡程度进行行为学评分,每项评分如下:无,记为0分;轻度,记为1分;中度,记为2分;重度,记为3分,总分为12分,评分在6～12分视为造模成功[7]。

1.2.2 大鼠分组处理[8]:按照随机数字表法将实验动物分为正常组、模型组、四磨汤低剂量组、四磨汤高剂量组、激活剂组。其中模型组、四磨汤低剂量组、四磨汤高剂量组、激活剂组大鼠按照上述造模术进行造模,而正常组大鼠在造模过程中仅暴露盲肠即可。

造模成功后30 min,四磨汤低剂量组大鼠每日定时以7.56 ml/kg的四磨汤进行灌胃处理,并以0.9%氯化钠溶液进行腹腔注射;四磨汤高剂量组大鼠每日定时以15.12 ml/kg的四磨汤进行灌胃处理,并以0.9%氯化钠溶液进行腹腔注射;激活剂组每日定时大鼠以15.12 ml/kg的四磨汤进行灌胃处理的同时并以5 mg/kg的PMA进行腹腔注射;而正常组和模型组大鼠每日定时以等剂量的0.9%氯化钠溶液进行灌胃处理和腹腔注射,各组大鼠单笼饲养,自由饮水与摄食,连续给药14 d。

1.3 实验检测指标

1.3.1 各组大鼠的一般状况以及血清指标检测:在实验过程中,每日记录大鼠的进食与饮水情况、精神状态、活动量、皮毛状态等日常行为参数。在末次给药结束后,将大鼠禁食不禁水12 h,尾静脉留取5 ml血液标本,离心后留取上清,按酶联吸附试剂盒要求进行实验操作,配置标准品溶液,终止反应,绘制标准曲线,酶标仪检测血清中TNF-α和IL-6的含量。

1.3.2 各组大鼠结肠组织的病理学检测:留取血液完毕,处死大鼠,显微镜下,逐层开腹,至暴露大鼠的结肠组织,在手术剪的帮助下,将大鼠的结肠组织取出,观察各组大鼠结肠黏膜的状态。将大肠结肠纵向剖开,观察其宏观损伤情况并进行评分:无充血、粘连,并且无水肿溃疡点记为0分;局部出现水肿、粘连或充血记为1分,并且每增加1个充血灶点评分即增加1分[9]。之后,以4%多聚甲醛将结肠组织固定,包埋,切片,脱蜡,进行HE、PAS染色,中性树胶封片,显微镜下观察大鼠结肠组织的病理损伤,统计每100个肠上皮细胞中杯状细胞的数量。

1.3.3 各组大鼠结肠组织的细胞凋亡:取大鼠的结肠组织,常规固定,制成切片,按TUNEL试剂盒要求检测各组大鼠结肠组织上皮细胞的凋亡情况,在显微镜下,凋亡的细胞呈现绿色荧光,正常细胞呈现蓝色荧光。Image J图像处理软件进行统计分析[10]。

1.3.4 各组大鼠结肠组织中HMGB1和NLRP 的表达:取大鼠的结肠组织,多聚甲醛固定,BSA封闭,加入一抗(HMGB1和NLRP3的稀释比例均为1∶100),在4 ℃下避光孵育过夜,充分清洗后,加入抗荧光二抗,防淬灭剂封片,镜下观察。

1.3.5 各组大鼠结肠组织中CD45、ZO-1和Claudin-1的表达:取大鼠的结肠组织,经固定,切片,脱蜡,脱水,抗原修复,封闭后,依次加入一抗(兔抗CD45、ZO-1和Claudin-1的稀释比例均为1∶200)、二抗(1∶1000),洗涤3次,常温下复染、封片后,镜下观察,当出现棕黄色颗粒视为目标蛋白表达[11],结果判定:①按阳性细胞百分数评分,0分,阳性细胞数≤5%;1分,6%<阳性细胞数≤25%;2分,26%<阳性细胞数≤75%;3分,>76%。②按细胞着色强度评分,0分,无着色;1分,淡黄色;2分,棕黄色;3分,棕褐色;将两项评分的乘积作为总评分。

1.3.6 各组大鼠结肠组织中NF-κB、NF-κB p65、Bcl-2和Bax的表达:取各组大鼠的结肠组织,通过RIPA裂解液提取样本中的总蛋白,待测定其浓度后,进行加热变性,取50 μg上样,电泳分离,转至PVDF膜上,封闭,加入兔抗大鼠NF-κB、NF-κB p65、Bcl-2和Bax一抗(各蛋白的稀释比例均为1∶500),过夜,洗涤3次,二抗(1∶1500)稀释后,室温孵育,洗涤,显影后,以GAPDH为参照[12],Image J软件进行统计。

1.4 统计学方法 采用SPSS 16.0统计学软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示,多组间比较采用单因素分析,两组间比较采用SNK-q检验;P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠的一般状态和行为学评分比较 见表1。在实验过程中,正常组大鼠精神状态、运动量、皮毛、进食与饮水量、排泄以及肛周未见异常;模型组大鼠精神状态萎靡,懒动,结膜炎严重,反应迟钝,皮毛竖立且暗淡无光,进食与饮水减少,肉眼可见稀水样便,肛周明显不清洁;与模型组比较,四磨汤低剂量组、四磨汤高剂量组以及激活剂组的行为明显改善,尤以四磨汤高剂量组大鼠改善的程度最为明显。实验结束时统计分析显示,四磨汤能明显改善重度脓毒症大鼠的行为,而PMA能部分逆转这一作用,差异均具有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠行为学评分比较(分)

2.2 各组大鼠结肠组织的解剖学、病理学、超微结构损伤以及结肠黏膜杯状细胞的变化 肉眼观察结肠黏膜,正常组大鼠结肠黏膜光滑未见异常;模型组大鼠的结肠黏膜颜色偏暗,结肠黏膜变薄,明显肿胀,可见明显的充血灶点或出血条带;与模型组比较,四磨汤低剂量组、四磨汤高剂量组以及激活剂组大鼠的结肠黏膜肿胀明显减轻,充血灶点明显减少或出血区域明显减小,尤以四磨汤高剂量组最为明显。统计分析结果显示,与正常组大鼠比较,模型组、四磨汤低剂量组、四磨汤高剂量组、激活剂组结肠组织的宏观评分明显升高;与模型组比较,四磨汤低剂量组、四磨汤高剂量组、激活剂组结肠组织的宏观评分明显降低;与四磨汤低剂量组比较,四磨汤高剂量组结肠组织的宏观评分明显降低;与四磨汤高剂量组比较,激活剂组结肠组织的宏观评分明显上升,差异具有统计学意义(均P<0.05),见表2。

表2 各组大鼠结肠组织宏观评分比较(分)

HE染色显示,正常组大鼠结肠黏膜各层分层清晰,未见异常,肠微绒毛正常,大肠腺结构清晰,分布丰富;模型组大鼠黏膜各层出现不同程度的水肿,炎性细胞大量浸润,肠微绒毛或脱落或丢失,大肠腺明显萎缩;与模型组比较,四磨汤低剂量组、四磨汤高剂量组以及激活剂组大鼠结肠黏膜损伤明显改善,炎性浸润明显缓解,尤以四磨汤高剂量组大鼠结肠组织黏膜损伤明显减轻(图1)。

图1 各组大鼠结肠组织损伤病理学表现(HE染色,×400)

肠道黏膜屏障的黏蛋白经PAS染色后,呈酒杯状的颗粒状[13];本研究PAS结果显示,与正常组比较,模型组、四磨汤低剂量组、四磨汤高剂量组、激活剂组结肠组织中的杯状细胞的数量明显降低;与模型组比较,四磨汤低剂量组、四磨汤高剂量组、激活剂组结肠组织中的杯状细胞的数量明显升高;与四磨汤低剂量组比较,四磨汤高剂量组结肠组织中的杯状细胞的数量明显升高;与四磨汤高剂量组比较,激活剂组结肠组织中的杯状细胞的数量明显降低,差异具有统计学意义(均P<0.05)。见表3。

2.3 各组大鼠结肠组织细胞凋亡率比较 见表4。TUNEL染色结果显示,与正常组大鼠比较,模型组、四磨汤低剂量组、四磨汤高剂量组、激活剂组大鼠结肠组织中的细胞凋亡率明显升高;与模型组比较,四磨汤低剂量组、四磨汤高剂量组、激活剂组大鼠结肠组织中的细胞凋亡率明显降低;与四磨汤低剂量组比较,四磨汤高剂量组大鼠结肠组织中的细胞凋亡率明显降低;与四磨汤高剂量组比较,激活剂组结肠组织中的细胞凋亡率明显上升,差异均具有统计学意义(P<0.05)。

表4 各组大鼠结肠组织细胞凋亡率比较(%)

2.4 各组大鼠血清中TNF-α和IL-6含量比较 见表5。酶联免疫吸附试剂盒检测结果显示,在模型组中,大鼠血清中TNF-α和IL-6的含量明显升高,四磨汤能明显抑制大鼠血清中TNF-α和IL-6的分泌,PMA能部分逆转这一作用,差异均具有统计学意义(P<0.05)。

表5 各组大鼠血清中TNF-α和IL-6含量比较(ng/L)

2.5 各组大鼠结肠组织中HMGB1和NLRP3水平比较 见表6。免疫荧光检测HMGB1和NLRP3的表达结果显示,模型组结肠组织中HMGB1和NLRP3的表达明显升高;四磨汤低剂量组、四磨汤高剂量组、激活剂组大鼠结肠组织中HMGB1和NLRP3的表达明显降低;与四磨汤高剂量组比较,激活剂组结肠组织中HMGB1和NLRP3的表达明显升高,差异均具有统计学意义(P<0.05)。

表6 各组大鼠结肠组织中HMGB1和NLRP3水平比较

2.6 各组大鼠结肠组织中CD45、ZO-1和Claudin-1表达比较 见表7(图2)。免疫组化结果显示,与正常组大鼠比较,模型组、四磨汤低剂量组、四磨汤高剂量组、激活剂组大鼠结肠组织中CD45、ZO-1和Claudin-1的表达明显降低;与模型组比较,四磨汤低剂量组、四磨汤高剂量组、激活剂组大鼠结肠组织中CD45、ZO-1和Claudin-1的表达明显升高;与四磨汤低剂量组比较,四磨汤高剂量组大鼠结肠组织中CD45、ZO-1和Claudin-1的表达明显升高;与四磨汤高剂量组比较,激活剂组大鼠结肠组织中CD45、ZO-1和Claudin-1的表达明显降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。

图2 各组大鼠结肠组织中CD45、ZO-1和Claudin-1表达比较(免疫组化染色,×400)

表7 各组大鼠结肠组织中CD45、ZO-1和Claudin-1免疫组化评分比较(分)

2.7 各组大鼠结肠组织中NF-κB、NF-κB p65、Bcl-2和Bax水平比较 见表8。Western blot结果显示,与正常组比较,模型组、四磨汤低剂量组、四磨汤高剂量组、激活剂组大鼠结肠组织中Bcl-2的表达明显降低,NF-κB p65、Bax的表达明显升高;与模型组比较,四磨汤低剂量组、四磨汤高剂量组、激活剂组大鼠结肠组织中Bcl-2的表达明显升高,NF-κB p65、Bax的表达明显降低;与四磨汤低剂量组比较,四磨汤高剂量组大鼠结肠组织中Bcl-2的表达明显升高,NF-κB p65、Bax的表达明显降低;与四磨汤高剂量组比较,激活剂组大鼠结肠组织中Bcl-2的表达明显降低,NF-κB p65、Bax的表达明显升高,差异具有统计学意义(均P<0.05)。

表8 各组大鼠结肠组织中NF-κB、NF-κB p65、Bcl-2和Bax水平比较

3 讨 论

脓毒症是累及肺、肝、肾、心、脑、肠等器官和组织的炎症反应综合征,肠道上皮损伤是重度脓毒症的重要因素之一[14]。因此深入阐明肠道上皮屏障损伤的分子机制,在该领域中具有重大意义。

脓毒症在中医学中隶属于“疽毒内陷”“外感热病”等范畴,机体因“正虚毒损,脉络失司”以至于热、虚、毒、瘀横行脉络,主要在“益气温阳、清热解毒、扶正祛邪、活血化瘀”的指导下形成了参附注射液、清热解毒方、香砂六君子汤、四磨汤、参白解毒方等名方用于临床上脓毒症的治疗,显示了较为稳定的疗效[15]。四磨汤为理气扶阳的代表药方,由木香、枳壳、乌药、槟榔组成。现代药理学研究显示[16],四磨汤以及其活性组分具有良好的抗炎、抗氧化、镇痛、免疫调节、脏器保护以及调节胃肠动力的作用。Yi等[17]研究显示在脾虚型便秘小鼠模型中,四磨汤能调控实验动物结肠黏膜组织中CD45、ZO-1和Claudin-1的表达,缓解动物结肠黏膜组织的病理损伤。周慧等[18]研究显示在心力衰竭大鼠模型中,四磨汤的应用能明显抑制动物体内炎症性应激的级联放大,下调动物血清中TNF-α和IL-6的水平。本研究中以CLP构建大鼠脓毒症模型后,四磨汤低剂量组、四磨汤高剂量组大鼠结肠黏膜组织中的细胞凋亡率明显下降,结肠组织中CD45、ZO-1和Claudin-1的表达升高,而HMGB1和NLRP3的表达降低,结肠组织病理损伤,结肠黏膜的黏膜蛋白损伤均明显减轻,证实四磨汤对疾病的干预作用。

肠道黏膜组织是机体抵御有害物质和病原微生物入侵的第一道防线。NF-κB信号是炎症性应激的关键通路之一,在脓毒症发生后,NF-κB被激活,NF-κB p65的表达升高,携带炎性信号入核,一方面能促进TNF-α和IL-6的分泌以及释放,炎症性应激呈现级联放大的“瀑布样”[19],另一方面促进晚期炎症介质HMGB1和NLRP3的表达,推动炎症性应激的进一步放大[20];同时诱导细胞中Bax表达的升高,下调Bcl-2的表达,诱使细胞凋亡,结肠黏膜损伤加剧[21]。本研究中以NF-κB信号激活剂PMA进行功能挽救,结果显示PMA能部分逆转四磨汤对结肠黏膜的修复作用,证实四磨汤通过抑制NF-κB信号而发挥作用。

综上所述,四磨汤能明显抑制重度脓毒症大鼠结肠上皮细胞的炎症应激状态,缓解结肠组织的病理损伤,改善结肠黏膜的屏障功能,这可能与抑制NF-κB信号的磷酸化有关。但是四磨汤是否还通过调控其他信号影响疾病的进展,仍需更为深入地研究。