响应面法优化马鞭草总黄酮超声波提取工艺研究及其抗氧化活性考察

邢佰颖，陈田雨，杨丽莹，李 婷，高 鹏

（山东中医药大学药学院，山东 济南 250355）

马鞭草（Verbena officinalisL.）又名土荆芥、铁马鞭等，原产于欧洲，主要生长于原野，在全世界的温带至热带地区均有分布。本品具有散瘀通经、清热凉血、解毒消胀、止痒驱虫的功效[1]。现代研究表明，马鞭草主要含环烯醚萜糖苷类、黄酮类[2]、三萜类、甾醇等化学成分[3]，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗早孕、调节免疫活性等作用[4]。目前对于马鞭草的研究报道并不多见，本项目组在单因素试验的基础上，采用响应面法优化马鞭草总黄酮的超声波提取工艺并研究其体外抗氧化活性，以期为该药的研究开发提供基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

UV-1100紫外可见光分光光度计（上海天美）；R201C型旋转蒸发器（巩义英峪高科仪器厂）；循环水式多用真空泵（郑州长城）；KQ-500E型超声波清洗器（昆山超声仪器公司）；恒温不锈钢水浴锅（上海树立）；YP10002电子天平（上海光正）；JY1002分析天平（上海精密科学仪器公司）；SZ-1型快速混匀器（江苏金坛金城国胜实验仪器厂）。

1.2 药品与试剂

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，Sigma）；芦丁对照品（纯度：≥98 %，上海源叶，批号：Y01M7S10307）；马鞭草（购自安徽亳州中药材市场，经山东中医药大学万鹏教授鉴定合格）；过氧化氢（天津富宇，批号：20161209）；L（+）-抗坏血酸，亚硝酸钠，三氯化铝，氢氧化钠（分析纯，国药集团）。

2 方法

2.1 马鞭草总黄酮超声提取工艺的优化

2.1.1 芦丁标准曲线的绘制 精密称取芦丁对照品5.00 mg，置入25 ml量瓶，加适量无水乙醇超声使溶解，以无水乙醇定容，摇匀，配成0.2 mg/ml的芦丁对照品溶液，备用。

精密移取芦丁对照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml，分别置入25 ml量瓶，加无水乙醇至6 ml，依次加入5 %NaNO2溶液1.00 ml，充分混匀后静置6 min，加入10 %AlCl3溶液1.00 ml，充分混匀后静置6 min，最后加入4 %NaOH溶液10 ml，并加无水乙醇定容至刻度，充分混匀后静置15 min[5]。以试剂空白为参比溶液，于506 nm处测各对照品溶液的吸光度[6]。以芦丁对照品质量浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标建立对照曲线。回归方程为A=0.0916C-0.0148，R2=0.9966，表明芦丁对照品溶液在4.00～40.00 μg/ml范围内浓度与吸光度的线性关系良好。

2.1.2 马鞭草总黄酮提取工艺流程 取马鞭草段（约为2 cm），准确称定，按设计好的实验条件进行超声提取，滤过，滤液减压回收乙醇并继续减压浓缩成稠膏，备用。

2.1.3 马鞭草总黄酮提取的单因素试验

2.1.3.1 超声时间对马鞭草总黄酮含量的影响 准确称取马鞭草段20 g，固定液料比为30:1，乙醇体积分数为60 %，考察超声时间分别为10，20，30，40，50，60 min条件下马鞭草提取物中总黄酮的含量。

2.1.3.2 液料比对马鞭草总黄酮含量的影响 准确称取马鞭草段20 g，固定超声时间为30 min，乙醇体积分数为60 %，考察液料比分别为10:1，20:1，30:1，40:1，50:1，60:1条件下马鞭草提取物中总黄酮的含量。

2.1.3.3 乙醇体积分数对马鞭草总黄酮含量的影响 准确称取马鞭草段20 g，固定超声时间为30 min，液料比为30:1，考察乙醇体积分数分别为40 %，50 %，60 %，70 %，80 %，90 %条件下马鞭草提取物中总黄酮的含量。

2.1.4 超声法提取工艺的响应面优化[7]在单因素试验结果的基础上，以马鞭草总黄酮的含量（Y）为响应值，选取超声时间(X1)、液料比(X2)、乙醇体积分数(X3)为影响因素，采用三因素三水平的试验设计进行Box-Behnken中心组合试验。响应面试验设计因素水平及编码见表1。

表1 马鞭草总黄酮提取响应面试验设计因素水平及编码

2.2 马鞭草总黄酮体外抗氧化试验

2.2.1 马鞭草总黄酮对DPPH的清除能力[8]将马鞭草浓缩液加无水乙醇配制成浓度分别为5，10，20，40，60，80 μg/ml的样品溶液。精密移取2 ml样品溶液于试管中，加入0.1 mmol/L的DPPH溶液2 ml，充分混匀，25 ℃下避光反应30 min，以无水乙醇为空白对照，于517 nm波长处测定其吸光度，平行测量3次。以抗坏血酸为阳性对照，精密称取一定量的抗坏血酸配制成相应浓度，按上述方法操作。

DPPH自由基清除率（%）=[1-(A样品-A空白)/A对照]×100 %

其中：A样品为样品溶液2 ml+DPPH溶液2 ml的吸光度；A空白为样品溶液2 ml+无水乙醇2 ml的吸光度；A对照为无水乙醇2 ml+DPPH溶液2 ml的吸光度。

2.2.2 马鞭草总黄酮对H2O2的清除能力[9]将马鞭草浓缩液加无水乙醇配制成浓度分别为5，10，20，40，60，80 μg/ml的样品溶液。精密移取2 ml样品溶液于试管中，加入2.5 %的H2O2溶液2 ml，充分混合，静置15 min，以蒸馏水为空白对照，于230 nm处测定其吸光度，平行测量3次。以抗坏血酸为阳性对照，精密称取一定量的抗坏血酸配制成相应浓度，按上述方法操作。

H2O2清除率（%）=[1-(A样品-A空白)/A对照]×100 %

其中：A样品为样品溶液2 ml+H2O2溶液2 ml的吸光度；A空白为样品溶液2 ml+无水乙醇2 ml的吸光度；A对照为无水乙醇2 ml+H2O2溶液2 ml的吸光度。

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果

3.1.1 超声时间的影响 超声时间对提取物中马鞭草总黄酮含量的影响见图1。

图1 超声时间对提取物中马鞭草总黄酮含量的影响

由图1可见，在液料比30:1，乙醇体积分数60 %的条件下，随着超声时间的延长，马鞭草总黄酮含量先增加后减小，在40 min时总黄酮含量最高，40～60 min含量降低。这可能是由于随着超声时间的延长，马鞭草中总黄酮在不断溶出，在40 min时提取较完全，再增加超声时间会使黄酮类物质破坏且增加杂质的溶出，降低总黄酮含量。因此，超声时间为40min时最佳。

3.1.2 液料比的影响 液料比对提取物中马鞭草总黄酮含量的影响见图2。

由图2可见，在超声时间为30 min，乙醇体积分数60 %的条件下，随着液料比的增加，提取物中马鞭草总黄酮含量先增加后减少，在液料比40:1时总黄酮含量最高。这主要是由于前期溶剂量的增多，增大了溶剂与溶质的接触面积，使有效成分浸出完全。当细胞内外达到扩散平衡时，黄酮不再浸出，此时总黄酮含量最高，再增加溶剂的量将不会提高总黄酮含量，反而浪费溶剂，为之后的蒸发浓缩带来困难。因此，液料比为40:1时最佳。

图2 液料比对马鞭草总黄酮含量的影响

3.1.3 乙醇体积分数的影响 乙醇体积分数对提取物中马鞭草总黄酮含量的影响见图3。

图3 乙醇体积分数对马鞭草总黄酮含量的影响

由图3可见，在超声时间30 min，液料比30:1的条件下，随着乙醇体积分数的增加，马鞭草总黄酮含量先增加后减少，在乙醇体积分数为60 %时总黄酮含量最高。但当乙醇体积分数继续增加时，会使脂溶性杂质如色素等的溶出量增加，降低总黄酮的含量，并且不易进行后期的分离纯化。因此，乙醇体积分数为40:1时最佳。

综上，选取单因素的提取条件为：超声时间40 min，液料比40:1，乙醇体积分数60 %。

3.2 响应面分析法试验结果

以单因素试验结果为基础，根据表1的设计因素水平与编码，采用Box-Behnken中心组合实验原理对马鞭草总黄酮的超声波提取工艺进行响应面法优化，以超声时间（X1）、液料比（X2）、乙醇体积分数（X3）为影响因素，马鞭草总黄酮含量（Y）为响应值进行三因素三水平试验，设计方案及结果见表2。

表2 响应面试验设计方案与结果

将所得数据通过Design-Expert 8.0软件进行多元回归拟合，得到的二元多项回归方程为：

回归方程分析见表3。

表3 回归方程方差分析

由表3可见，模型组的F值为207.91，模型差异极显著（P＜0.01）。一次项X1、X2、X3对模型的影响均极为显著（P＜0.01），R2=0.9963，数据表明所选取的模型相关度较好，可行性强。由F值可得各个因素对马鞭草总黄酮含量影响的大小顺序：乙醇体积分数（X3）＞液料比（X2）＞超声时间（X1）。

通过Design-Expert 8.0软件对超声时间（X1）、液料比（X2）、乙醇体积分数（X3）各因子间的交互作用进行分析，得到了图4～图6的响应面和等高线图。响应面图中，响应面越陡峭，则该因素对响应值的影响越显著；相反则该因素影响不显著。在等高线图中，可直接观察到各影响因子交互作用程度，等高线接近于圆形，影响因子交互作用不强；相反，等高线接近于椭圆形，说明两个影响因子间的交互作用较强[10]。由图4、图6可见超声时间（X1）与液料比（X2）、液料比（X1）与乙醇体积分数（X3）的等高线接近于椭圆，说明超声时间（X1）与液料比（X2）及液料比（X1）与乙醇体积分数（X3）有较强的交互作用。由图5可见超声时间（X1）与乙醇体积分数（X3）的等高线接近于圆形，说明超声时间（X1）与乙醇体积分数（X3）交互作用较小。

图4 提取时间和液料比对总黄酮含量的响应面和等高线分析图

图5 提取时间和乙醇体积分数对总黄酮含量的响应面和等高线分析图

图6 液料比和乙醇体积分数对总黄酮含量的响应面和等高线分析图

3.3 最佳提取工艺及验证试验

响应面法得到的最佳提取工艺为：超声时间40 min，液料比50:1，乙醇体积分数60 %，提取物中马鞭草总黄酮含量的预测值为3.31 %。对最佳提取工艺为进行验证，得到马鞭草总黄酮含量的平均实测值为3.26 %（n=3），实测值与预测值的误差为1.51 %[11]，说明响应面法得到的最佳提取工艺有较强的可行性。

3.4 马鞭草总黄酮清除DPPH的能力

以马鞭草总黄酮和抗坏血酸的质量浓度（μg/ml）为横坐标，DPPH的清除率（%）为纵坐标绘制曲线，见图7。由图7可见，5～20 μg/ml浓度范围内，马鞭草总黄酮的清除率小于抗坏血酸（P＜0.05），但随着浓度的增加，40～80 μg/ml浓度范围内马鞭草总黄酮的清除率大于抗坏血酸（P＜0.05）。

图7 马鞭草总黄酮清除DPPH自由基的能力

3.5 马鞭草总黄酮清除H2O2的能力

以马鞭草总黄酮和抗坏血酸的质量浓度（μg/ml）为横坐标，H2O2的清除率（%）为纵坐标绘制曲线，见图8。由图8可见，马鞭草总黄酮和抗坏血酸清除H2O2能力均与质量浓度成正比，马鞭草总黄酮对H2O2的清除作用大于抗坏血酸（P＜0.05）。

图8 马鞭草总黄酮清除H2O2的能力

4 讨论

4.1 马鞭草具有多种活性成分，其中黄酮类化合物的研究逐渐被大家所重视。本项目组采用超声法提取马鞭草总黄酮，提取效率高，成分破坏少，并用响应面法优化马鞭草总黄酮的提取工艺，得到最佳提取条件为超声时间40 min，液料比50:1，乙醇体积分数60 %。根据验证试验得到的实测值为3.26 %，与预测值3.31 %的误差为1.51 %，说明该提取工艺有较强的可行性。

4.2 通过测定马鞭草总黄酮清除DPPH自由基和H2O2的能力，表明其具有较强的体外抗氧化活性。

4.3 通过上述研究，确定了马鞭草总黄酮的最佳提取工艺，为其全面开发与利用提供理论依据；同时，马鞭草总黄酮具有较好的抗氧化能力，可作为保健品及化妆品的原料，有较好的开发前景。