云南产油菜蜂花粉多糖抗肝损伤作用的研究

魏淑飞，左绍远，罗永会

（1. 九江学院附属医院 病理科，江西 九江 332000 ；2. 大理大学基础医学院，云南 大理 671000）

蜂花粉营养丰富，是我国传统的营养保健食品。多糖是蜂花粉的主要活性成分之一，有抗肿瘤、提高机体免疫力、降血糖、降血脂等多种生物学活性[1-2]。多糖的生物学活性通常与其纯度及化学结构关系密切[3-5]，所以多糖提取工艺中脱蛋白方法尤为重要。由于受水文、地理、采集时间及季节等因素的影响，不同产地的蜂花粉多糖在多糖含量、单糖组成、结构、生物学活性、药理学作用等方面均有一定差异。目前国内对青海、甘肃、新疆、内蒙、四川、湖北等油菜主产地的油菜蜂花粉多糖研究较多，而有关云南产的油菜蜂花粉多糖的研究目前尚未见有报道[6-7]。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、木瓜蛋白酶、丙氨酸氨基转氨酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转氨酶（AST）测定试剂盒（南京建成生物研究所），其余试剂均为国产分析纯试剂（AR）。云南产油菜蜂花粉（云南永胜蜂业公司），多糖（大理大学生物化学实验室提取）。

1.2 实验动物

昆明种小鼠50只，雌雄兼用，体重20～30 g，由大理大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK 2014-004。

1.3 主要仪器

HH-4 数字恒温水浴锅（国华电器），SAH-C水浴恒温振荡器（金坛市杰瑞尔电器），722E型可见分光光度计（上海光谱仪器公司）。

1.4 方法

选取昆明种小鼠50只，雌性各半，体重20～30 g，适应性喂养一周后，随机分成RBPP高、中、低剂量组、正常对照组和肝损伤模型组。RBPP高、中、低剂量组分别灌胃给予相应的药物溶液10 ml/kg，正常对照组与肝损伤模型组则给予等体积生理盐水，每天1次，连续14 d，末次给药2 h后，模型组和RBPP高、中、低剂量组腹腔注射0.1 % CCl4花生油溶液10 ml/kg，正常对照组腹腔注射等体积的花生油溶液。禁食（不禁水）12 h，各组小鼠断头取血，离心取血清，按试剂盒说明书操作，分别检测血清AST、ALT活检、肝组织MDA含量及SOD活性。剖腹取小鼠肝脏，置于生理盐水中漂洗，除去血渍，滤纸拭干，取每只小鼠肝脏的相同部位，制作病理切片，常规HE染色，观察各组小鼠肝组织学形态的变化。

1.5 统计学处理

应用SPSS16.0统计软件，实验数据以均数±标准差表示，组间差异按方差分析进行t检验。结果以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对肝损伤小鼠血清AST、ALT的影响

结果见表1。与正常对照组相比，模型组小鼠血清AST、ALT显著升高（P＜0.01），提示造模成功。与模型组比较，RBPP各剂量组血清AST均下降，但仅RBPP中、高剂量组差异具有统计学意义。并且RBPP低、中、高剂量组小鼠血清ALT的含量均显著降低（P＜0.01）。

表1 RBPP对肝损伤小鼠血清AST、ALT含量的影响（± s，n=8）

表1 RBPP对肝损伤小鼠血清AST、ALT含量的影响（± s，n=8）

注：△P＜0.01 vs 正常对照组，** P＜0.01 vs 模型组

组别 AST/IU·L-1 ALT/IU·L-1正常对照组 69.16±9.74 54.43±4.70模型组 126.38±24.70△ 151.33±13.16△RBPP 100 mg/(kg·d)组 123.58±33.57 122.13±19.43**RBPP 150 mg/(kg·d)组 86.77±14.90**110.94±4.87**RBPP 300 mg/(kg·d)组 85.87±26.78** 97.24±11.13**

2.2 对肝损伤小鼠肝组织SOD活性、MDA含量的影响

结果见表2。与正常对照组比较，模型组SOD活性显著下降，而MDA含量升高，表明小鼠注射0.1 % CCl4后，小鼠抗氧化能力明显降低。而RBPP能明显拮抗CCl4的毒性作用，使小鼠抗氧化能力回升。与模型组比较，RBPP各剂量组均可增强CCl4所致急性肝损伤小鼠抗氧化能力，使小鼠肝脏SOD活性明显回升，MDA含量显著下降。且高剂量组SOD活性已恢复到了正常水平。

表2 RBPP对肝损伤小鼠肝组织SOD活性、MDA含量的影响（± s，n=8）

表2 RBPP对肝损伤小鼠肝组织SOD活性、MDA含量的影响（± s，n=8）

注：△P＜0.01 vs 正常对照组，** P＜0.01 vs 模型组

组别 SOD/U·mg prot-1MDA/U·mg prot-1正常对照组 144.88±6.04 2.24±0.44模型组 116.42±8.52△ 8.59±0.48△RBPP 100 mg/(kg·d)组 134.72±7.48** 6.58±0.61**RBPP 150 mg/(kg·d)组 135.82±10.8** 3.73±0.17**RBPP 300 mg/(kg·d)组 145.46±12.08** 3.36±0.56**

2.3 对肝损伤小鼠的肝组织形态的影响

结果见图1。结果表明，肉眼观：正常对照组小鼠肝脏颜色呈红褐色，质软，模型组小鼠肝脏水肿，边缘变钝，肝脏颜色灰褐色。镜下：正常对照组小鼠肝小叶结构清晰可见，条索状结构以中央静脉为中心呈放射状排列，肝窦清晰可见；模型组小鼠正常肝小叶结构被破坏，细胞条索状结构解离，肝细胞明显水肿，可见较多的点状死灶，并伴有炎症细胞广泛浸润；RBPP低剂量组与模型组对比，肝细胞水肿变性，点状坏死及炎性细胞浸润改善不明显；RBPP中剂量组肝细胞水肿、坏死较模型组有明显减轻；RBPP高剂量组较模型组肝细胞损伤有显著减轻，肝细胞排列较整齐，水肿变性、坏死明显减轻，肝小叶结构基本完整，只有少量的炎症细胞浸润。

图1 云南产油菜蜂花粉多糖对肝损伤小鼠肝组织病理学改变的影响（×200）

3 讨论

目前认为，CCl4建立的肝损伤模型主要机制与自身产生的自由基及其产物有关，CCl4进入机体产生的自由基，在肝脏细胞色素酶P450的作用下分解成三氯甲基自由基和氯自由基。这些自由基的破坏能力极强，不仅破坏细胞膜、细胞器，且攻击细胞膜上的磷脂质分子，共价结合膜脂质和蛋白质大分子，致使机体内的蛋白质代谢紊乱，破坏肝细胞膜的结构和功能，导致肝细胞失去正常的生理功能，最终导致肝细胞坏死[8]。因此SOD及MDA含量可间接表示云南产油菜蜂花粉多糖小鼠的肝脏保护作用，结果表明，与对照组相比，云南产油菜蜂花粉多糖300，150，100 mg/kg剂量组均可显著提高肝组织SOD活性，降低肝组织MDA含量。表明云南油菜蜂花粉多糖具有显著的清除自由基、保护肝脏能力。

AST、ALT为测定肝功能最主要的两种酶，ALT存在于肝细胞内，AST主要分布在线粒体；当肝细胞受损伤时，细胞膜最先受损，因而ALT最先进入血液，只有当肝细胞损伤累计到线粒体时，血液中的AST才会升高。有研究表明，CCl4制作的肝损伤模型，在小鼠腹腔注射0.1 % CCl4花生油溶液24 h后，AST、ALT含量达到最高峰[9]。但由于CCl4制作肝损伤模型的死亡率很高，达到80 %以上[10]，所以本实验于腹腔注射0.1 % CCl4花生油溶液12 h后处死检测相应指标。结果表明，与正常对照组比较，模型组AST、ALT升高显著，表明模型建立成功。与模型组比较，不同剂量的多糖给药均能显著的降低小鼠血清AST、ALT含量，提示云南产油菜蜂花粉多糖具有较强的保护肝损伤的能力。