外源性硫化氢对大鼠精索静脉曲张生精功能损伤的保护作用

柯 炜 ，叶志华

（1. 武穴市第一人民医院，湖北 武穴 435400；2. 鄂东医疗基团黄石中心医院（湖北理工学院附属医院），湖北 黄石 435000）

精索静脉曲张（varicocele，VC）是泌尿外科 中比较常见的疾病，表现为蔓状静脉和精索内静脉异常扩张、伸长和迂曲，多见于青壮年，以左侧多见，发病率约为15 %，在导致男性不育症的病因中居首位[1]。其机制较复杂，可能与睾丸微循环、血管活性物质、氧化应激、一氧化氮、缺氧、免疫及凋亡等多种因素有关。硫化氢（H2S）作为一个新型的气体信号分子，在多种器官的损伤过程中,发挥广泛的保护作用[2]。本研究通过建立大鼠VC模型，观察外源性H2S对睾丸生精功能的影响，为VC的防治提供新的手段。

1 材料与动物

1.1 材料

NaHS（H2S外源性供体，Sigma 公司）；丙二醛（MDA）检测试剂盒，超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（南京建成）；原位细胞凋亡检测试剂盒（德国罗氏）；Caspase-3，Bax抗体（加拿大圣克鲁斯公司）；免疫组化检测试剂盒（福建迈新）；RNA 提取试剂盒及逆转录试剂盒（威佳科技）。

1.2 动物

36只成年健康雄性SD大鼠，体重250～280 g，购于湖北省疾病预防与控制中心。

2 方法

2.1 动物分组与造模

SD大鼠随机分为3组，每组12只。实验前，所有大鼠饲养在恒定温度的房间（22±2 ℃），给予相同的食物和水。采用2 %戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔麻醉,常规消毒铺单，腹正中切口。假手术组：左肾静脉暴露后，仅分离而不结扎，4-0丝线缝合切口；模型组：仔细分离肾上腺静脉和精索静脉内侧的左肾静脉段，在左肾静脉上平行放置一直径约0.4 mm的光滑的金属杆，并用4-0丝线结扎，使左肾静脉直径缩窄为原来的一半后将金属杆拉出，使左肾静脉复通。4周后，左精索静脉异常扩张，同时左肾无明显病理性萎缩，为VC模型成功建立的标准；外源性硫化氢组：在模型组成功建立的基础上，同时于腹腔注射NaHS[20 mg/(kg·d)]。VC术后4周，取各组大鼠左侧睾丸，仔细剪除附着的脂肪组织和筋膜，生理盐水冲洗后以滤纸拭干，纵向将其切成两半，一半组织用于组织学检查，常规HE染色，观察睾丸组织的形态学改变；另一半组织放置液氮中冷冻后放置-80 ℃冰箱保存。

2.2 MDA和SOD测定

冷冻的睾丸组织匀浆、离心（3000 r/min，12 min）后收集上清。按试剂盒说明书，采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量（nmol/g蛋白），采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性（U/mg蛋白）。

2.3 生精细胞凋亡检测

利用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法检测生精细胞凋亡，细胞核染成棕黄色者为阳性细胞，光镜下（×200）每张切片选取10个连续不重叠的视野，计算细胞总数和阳性细胞数。凋亡指数（AI）=阳性细胞数/细胞总数×100 %。

2.4 免疫组化

采用免疫组化染色分析Caspase-3和Bax的表达。组织用4 %多聚甲醛固定，石蜡包埋后切片，厚4 μm。按说明书指示进行，加入Caspase-3、Bax抗体及相应二抗，PBS洗涤后DAB显色5 min后封片，显微镜下棕褐色为阳性染色。

2.5 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）

取冷冻睾丸组织样本提取总R N A。取1 μg总RNA逆转录成cDNA，采用PCR基因扩增仪进行扩增。反应方案依据试剂盒操作步骤进行，引物序列如下：Caspase-3正义链5’-TGGACTGCGGTATTGAGACA-3’，反义链5’-GCGCAAAGTGACTGGATGAA-3’；Bax正义链5’-GCCTCCTGACTCCAGGTCC-3’，反义链5’- GTGCAGGGTCCG AGGT-3’； GAPDH正义链5’-TGCTATGTTGCCCTAGAC-3’，反义链5’-GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3’。软件分析各组的循环阈值（Ct），最终数据以2-△△Ct进行分析，得出各组基因mRNA表达量。

2.6 统计学分析

采用SPSS19.0 统计软件进行统计分析，计量资料以±s表示，采用t检验进行统计；计数资料比较采用 χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 睾丸组织的病理学改变

假手术组未见明显的组织病理学改变，可见各级生精细胞排列有序，管腔有大量精子；模型组可见曲细精管管腔间隙明显增大，各级生精细胞排列紊乱且广泛脱落；外源性硫化氢组可见生精细胞排列正常或轻度紊乱，少数腔内见脱落的生精细胞（见图1）。

图1 睾丸组织病理学改变

3.2 睾丸组织中MDA含量和SOD活性变化

模型组MDA含量较假手术组明显增加，外源性硫化氢组MDA含量较模型组明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与假手术组相比，模型组SOD活性显著降低，H2S处理后增加了睾丸组织中SOD的活性，差异均有统计学意义（P＜0.05）（见表1）。

表1 睾丸组织中MDA含量与SOD活性的变化（±s，n=12）

表1 睾丸组织中MDA含量与SOD活性的变化（±s，n=12）

注：*P＜0.05 vs 假手术组，#P＜0.05 vs 模型组

组别 MDA含量/nmol·g-1 SOD活性/U·mg-1假手术组 1.64±0.39 0.72±0.04模型组 4.32±0.86* 0.19±0.02*外源性硫化氢组 2.65±0.43*# 0.56±0.03*#

3.3 睾丸生精细胞凋亡情况

假手术组可见较少的睾丸生精细胞凋亡；模型组凋亡细胞明显增加，与假手术组相比有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，外源性硫化氢组生精细胞凋亡明显减少，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 睾丸组织生精细胞凋亡指数（±s，n=12）

表2 睾丸组织生精细胞凋亡指数（±s，n=12）

注：*P＜0.05 vs 假手术组，#P＜0.05 vs 模型组

假手术组 3.78±0.27模型组 16.53±1.25*外源性硫化氢组 8.48±0.72*#

3.4 睾丸组织中Bax与Caspase-3的表达

免疫组化染色检测睾丸组织Bax、Caspase-3的表达，结果显示假手术组仅可见生精细胞细胞质和细胞核中散在的阳性表达；模型组中，其阳性表达较假手术组明显增多，表现为细胞质和细胞核呈黄色或棕黄色；外源性硫化氢组阳性表达较模型组明显减少，见图2。RT-PCR法检测Bax、Caspase-3 mRNA表达水平，与假手术组相比，模型组Bax、Caspase-3的mRNA表达水平显著升高；与模型组相比，外源性硫化氢组Bax、Caspase-3 mRNA表达水平显著降低，差异均有统计学意义，见图3。

图2 睾丸组织Bax和Caspase-3免疫组化图

图3 睾丸组织中Bax和Caspase-3 mRNA表达

4 讨论

H2S是继内源性一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后的第三种气体信号分子，无色，有臭鸡蛋气味，可溶于水及脂溶性溶剂，在体内以H2S/NaHS的形式保持动态平衡[3]。研究显示，大部分生物和药理实验中，硫氢化钠（NaHS）被用作H2S的供体，在水中溶解后短时间内即释放出大量H2S，具有抗氧化、抗炎及抗凋亡等作用[4-5]。Liang等[6]发现一定浓度的外源性H2S可通过阻断TLR4通路，减少心肌细胞的炎性损伤。Guan等[7]报道了H2S可明显减少氧自由基生成，从而对急性肺损伤产生保护作用。Hosgood等[8]使用无心跳供体的猪肾移植模型观察外源性H2S对肾缺血再灌注损伤的作用，发现使用H2S可明显降低血肌酐并能改善再灌注后肾功能的恢复。本实验采用HE染色观察VC对大鼠睾丸组织学变化的影响，结果显示：模型组中睾丸曲细精管管腔间隙明显增大，各级生精细胞排列紊乱，且生精细胞出现广泛脱落现象，这严重影响了睾丸结构及生精功能；外源性H2S治疗后明显改善了VC引起的组织学损伤。

氧化应激是活性氧自由基过量产生，从而致抗氧化机制破坏的结果。过量的氧自由基可与细胞内重要的分子如蛋白质、脂质和核酸等发生反应，破坏了其正常的功能，导致一系列细胞功能障碍或死亡[9-10]。哺乳动物的睾丸对氧化应激水平高度敏感，VC过程与氧自由基过度产生紧密相关[11]。正常情况下，SOD是细胞生长、分化过程中的重要组成部分，可催化超氧阴离子自由基歧化为过氧化氢，其活性反映了机体氧自由基清除的能力；而MDA是脂质氧化的一种重要产物，通常可作为评价氧化应激水平的标志物[12]。研究发现，H2S可明显减少机体内氧自由基的生成，在预防多个系统器官的氧化应激损伤中具有治疗潜力[13]。我们的研究发现，H2S处理后，可使VC睾丸组织中的SOD活性明显升高，MDA含量降低，这表明外源性H2S对VC睾丸的氧化应激损伤产生了保护作用。

细胞凋亡是一种基于遗传学机制的正常生理现象，是通过诱导一系列形态和生化改变导致细胞死亡的过程[14]。同时，细胞凋亡也是生精过程中一个关键的调节因子，在维持精子发生的动态平衡中起着重要的作用，凋亡过程的改变会使生精细胞发生异常凋亡，从而引起不育[15]。VC引起的损伤具有复杂的病理过程,凋亡是缺血、缺氧性损伤发生发展的关键因素。Zheng等[16]在大鼠VC模型中发现，睾丸生精细胞凋亡较术前明显增加，且损伤程度与损伤时间呈正相关，从而引起睾丸功能受损致男性不育。在人类凋亡通路级联反应中，Caspase-3和Bax是细胞凋亡机制中必不可少的组成部分。当机体接受凋亡刺激时，其激活可引起细胞底物的降解并参与多种发病机制，如睾丸生精障碍，精子活力和精子DNA水平降低等[17]。其中，Bax是Bcl-2家族的主要蛋白之一，它可促进cytc从线粒体释放，从而引起细胞凋亡；Caspase-3 是介导细胞凋亡的关键效应酶，同时也是多种凋亡刺激信号传递的汇聚点，它的活化是细胞凋亡进入不可逆阶段的标志[18]。Bos等[19]发现外源性H2S可抑制Caspase-3的激活，从而达到抗凋亡作用。还有研究显示，通过建立雄激素缺乏模型，发现睾丸组织中生精细胞凋亡引起睾酮的降低是Caspase-3依赖性的，表明Caspase-3激活参与并诱导生精细胞凋亡[20]。本实验模型组Caspase-3、Bax的表达明显高于假手术组, 其生精细胞凋亡指数显著升高；经H2S处理后，其表达及细胞凋亡指数较模型组明显降低。以上结果证明H2S对VC引起的睾丸生精细胞产生抗凋亡作用。

综上所述，H2S可减轻氧化应激水平和抑制凋亡，从而对VC睾丸生精功能发挥保护作用，其作用机制还需深入研究。