HPLC测定胸腺素α1-胸腺五肽融合肽的含量

王彦厚，王凤山

（1. 山东大学药学院，山东 济南 250012；2. 淄博市食品药品检验研究院，山东 淄博 255086）

胸腺五肽（thymopentin，TP5）是位于胸腺生成素Ⅱ的第32～36位氨基酸残基片段，也是胸腺生成素Ⅱ的活性中心，能双向调节失衡的免疫系统，是一种重要的免疫调节剂[1-2]。胸腺素α1（thymosin α1，Tα1）是一种天然存在于多种生物组织的多肽物质，由28个氨基酸残基组成[3]，作为免疫增强剂用于临床[4-6]。TP5和Tα1具有相似的免疫调节活性，但TP5的体内半衰期（t1/2）很短（约30 s），需要频繁给药才能维持疗效；Tα1的体内t1/2较长（约100 min）。

为提高TP5的活性，延长其体内t1/2，本课题组前期借助基因工程方法，将具有相似生物活性与临床用途的TP5 和Tα1连接在一起，采用大肠杆菌表达系统对Tα1-TP5进行融合表达，通过优化发酵工艺，成功进行了中试规模的生产，获得了Tα1-TP5融合肽。为更好地控制Tα1-TP5融合肽的质量，建立了高效液相色谱法（HPLC）测定胸腺素α1-胸腺五肽融合肽的含量，以保证该产品 的质量和疗效[7]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-2010C型高效液相色谱仪[岛津（中国）]；UV2401PC型紫外可见分光光度计[岛津（中国）]；AB104型电子分析天平（梅特勒-托利多）；PHS-3C型精密pH计（上海仪电）。

1.2 试药

乙腈（色谱纯，Honeywell International Inc.）；磷酸（色谱纯，上海阿拉丁）；无水磷酸氢二钠（分析纯，国药集团）；Tα1-TP5融合肽（山东金城生物药业，批号：TT-20170601，TT-20170602，TT-20170603）。

2 方法与结果

2.1 检测波长的选择

精密称取Tα1-TP5融合肽（批号：TT-20170601）10.36 mg，置于50 ml量瓶中，加水使溶解并定容至刻度，得溶液A；量取溶液A 5 ml，置于50 ml容量瓶中，加水稀释并定容至刻度，过滤，得样品溶液。照中国药典2015年版四部 通则0401紫外-可见分光光度法[7]，在190～400 nm波长范围内扫描，确定最大吸收波长。本品的紫外吸收谱图见图1。结果显示：本品在208 nm波长处有最大吸收，故选择208 nm作为检测波长。

图1 Tα1-TP5融合肽的紫外吸收谱图

2.2 供试品溶液的制备

精密称取Tα1-TP5融合肽（批号：TT-20170601）10.0 mg，置于10 ml量瓶中，加入流动相摇匀使溶解，稀释至刻度，作为供试品溶液。

2.3 色谱条件与系统适用性

色谱柱为Agilent ZORBAX 80A Extend-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.05 mol/L磷酸氢二钠溶液（用磷酸调pH至7.5）-乙腈（9:1，v/v）；流速为0.6 ml/min；检测波长为208 nm；进样量为20 μl。

2.4 方法学考察

图2 空白溶剂液相色谱图

图3 供试品溶液HPLC色谱图

2.4.1 专属性试验 分别精密量取蒸馏水（空白溶液）、供试品溶液各20 μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果见图2和图3。结果表明：供试品溶液中，7.42 min为主成分峰，检出3个杂质峰，出峰时间分别为4.10，5.62，10.08 min。表明本方法专属性良好，溶剂不干扰样品的检测，能满足含量测定的要求。

2.4.2 线性关系试验 精密称取Tα1-TP5融合肽（批号：TT-20170601）19.1 mg，置于10 ml量瓶中，加入流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备溶液；分别精密量取贮备溶液1 ml，加适量流动相，制成浓度分别为0.479，0.766，0.957，1.126，1.367 mg/ml的溶液，备用。按2.3项色谱条件，精密量取以上各浓度溶液各20 μl，分别注入液相色谱仪，以浓度为横坐标（C），峰面积为纵坐标（A），进行线性回归，并求出线性方程，结果表明：Tα1-TP5融合肽在0.479～1.367 mg/ml浓度范围内，浓度（C）与峰面积（A）线性关系良好（r=0.9998）。

2.5 精密度试验

精密量取供试品溶液，重复进样6次，进样量20 μl，记录色谱图，Tα1-TP5融合肽主成分峰面积的RSD（n=6）为0.44 %。表明本法精密度良好。

2.6 重复性试验

精密称取6份Tα1-TP5融合肽（批号：TT-20170601）10.0 mg，分别置于10 ml量瓶中，加入流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。精密量取上述供试品溶液各20 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明：6份供试品溶液中，杂质1、杂质2、主成分、杂质3、总杂质的平均峰面积归一化法计算含量分别为0.314 %，0.049 %，98.831 %，0.807 %，1.170 %，RSD分别为3.78 %，8.97 %，0.04 %，3.73 %，3.10 %，均小于10 %。表明采用本法测定Tα1-TP5融合肽的含量，重复性良好。

2.7 检出限和定量限

量取2.4.2 项下浓度为0.479 mg/ml的溶液适量，配制成不同浓度的系列稀释溶液，分别量取各稀释溶液20 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。当Tα1- TP5融合肽的浓度为0.957 μg/ml，进样量为20 μl时，S/N=10.73，表明采用本法测定Tα1-TP5融合肽含量的定量限为19.14 ng/ml；当Tα1-TP5融合肽的浓度为0.319 μg/ml，进样量为20 μl时，S/N=3.76，表明采用本法测定Tα1-TP5融合肽含量的检出限为6.38 ng/ml。

2.8 溶液稳定性

将供试品溶液置于约30 ℃条件下放置，分别于第0，3，6，12 h取样，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。杂质1、杂质2、主成分、杂质3含量RSD分别为8.94 %，21.48 %，0.09 %，5.91 %，结果表明室温下放置12 h内，供试品溶液中杂质1和杂质2含量有增加趋势，含量间RSD分别为8.94 %，21.48 %，显示供试品溶液在室温条件下不稳定，溶液须现配现用。

2.9 样品测定

分别取3批Tα1-TP5融合肽（批号：TT-20170601，TT-20170602，TT- 20170603），按2.2项方法配制供试品溶液，按2.3项色谱条件，以归一化法计算样品的含量分别为98.76 %，98.34 %，98.90 %。

3 讨论

本文对流动相进行了考察。采用磷酸盐缓冲液（pH 7.0）-甲醇（90:10）为流动相，在记录时间内未检测出有效峰；采用磷酸盐缓冲液（pH 7.0）-甲醇（70:30）为流动相，检测出有效峰，但基线噪音较大；分别以水-甲醇（70:30）、水-甲醇（90:10）为流动相，检测出有效峰，但出峰时间较靠前，与溶剂峰重合；以磷酸盐缓冲液（pH 7.5）-乙腈（90:10）为流动相，检测出有效峰，且主峰和相邻杂质分离度较好，杂质也可有效检出，故选择此条件进行试验。

实验中考察了Agilent ZORBAX 80A Extend-C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）和超宽pH耐受范围（pH 1.0～12.5）的Welch Xtimate-C18柱（150 mm×4.6 mm，3 μm），不同流速（0.5，0.6，0.7 ml/min），不同流动相pH值（7.0，7.5，8.0）条件下的分离效果。结果显示各条件下均能取得良好的分离效果，采用峰面积归一化法计算含量结果基本一致。此方法色谱峰分离度好，峰形良好，保留时间适中，适用于Tα1-TP5融合肽含量测定。