LC-MS/MS法测定遗传毒性杂质9-丙烯基腺嘌呤

王秀珍，张治云，宋永保，杨海霞*

（1. 山东省药学科学院，山东 济南 250101；2. 山东省化学药物重点实验室，山东 济南 250101；3. 山东海佑福瑞达制药有限公司，山东 临沂 276700）

富马酸替诺福韦二吡呋酯是一种新型开环膦酸核苷类化合物（ANP），是替诺福韦的前体药物[1]，可有效对抗多种病毒，是治疗艾滋病、乙型肝炎的重要药物[2-5]。9-丙烯基腺嘌呤（结构式见图1）是富马酸替诺福韦二吡呋酯在合成过程中由起始原料替诺福韦引入或在贮存过程中降解产生的遗传毒性杂质，须严格控制含量。目前文献报道9-丙烯基腺嘌呤的含量测定方法多采用LC-MS法[6-10]，有文献采用单离子模式（SIM）扫描，选择性较多反应监测（MRM）模式差；有文献虽采用MRM模式，但或需采用UPLC分离，对仪器要求高；又或对流动相和色谱柱有较高要求。本文建立的LC-MS/MS检测方法采用HPLC分离，其专属性、准确度明显优于已报道的方法，可用于富马酸替诺福韦二吡呋酯中9-丙烯基腺嘌呤的含量测定。

图1 9-丙烯基腺嘌呤的结构式

1 仪器与试药

岛津LC-20AD高效液相色谱仪（岛津仪器公司），AB SCIEX 4000 QTRAP质谱仪，Analyst1.6.1数据采集与处理软件（AB公司）。

9-丙烯基腺嘌呤对照品（USP标准品，批号：FOK085，含量：97 %）；乙腈、甲醇（Fisher Scientific公司，色谱纯）；乙酸铵（天津科密欧，分析纯）；水（杭州娃哈哈，饮用纯净水）。

2 方法与结果

2.1 色谱质谱条件

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；流动相：10 mmol/L醋酸铵：乙腈=65:35（v/v）；柱温：30 ℃，流速为1.0 ml/min，进样体积为10 μl。采用电喷雾离子源，MRM模式，正离子扫描方式检测，检测离子通道为m/z：176.1/136.1。

2.2 溶液配制

对照品贮备液：精密称取9-丙烯基腺嘌呤对照品适量，加甲醇溶解并定量稀释制成每1 ml中含0.05 μg溶液。

对照品溶液：精密量取对照品储备液2 ml置入10 ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀（每1 ml中含9-丙烯基腺嘌呤0.01 μg）。

供试品溶液：精密称取本品适量，加甲醇溶解并定量稀释制成每1 ml中含2 mg溶液。

2.3 专属性试验

取空白溶剂（甲醇）、对照品溶液、供试品溶液及供试品和对照品的混合溶液按“2.1”项下色谱质谱条件依次进样测定，典型色谱图见图2。结果表明，空白溶剂和供试品溶液对9-丙烯基腺嘌呤测定无干扰，方法专属性良好。

图2 9-丙烯基腺嘌呤专属性试验的MRM色谱图

2.4 线性关系试验

分别精密量取9-丙烯基腺嘌呤对照品贮备液0.1，0.2，0.4，1.0，2.0，3.0，5.0 ml置入10 ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得系列对照品溶液，按“2.1”项下色谱质谱条件依次进样测定，以9-丙烯基腺嘌呤浓度（C，ng/ml）对峰面积（A）进行线性回归，得标准曲线方程：A=1335.8C-165.27，r=0.9999，9-丙烯基腺嘌呤在0.49～24.50 ng/ml浓度范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.5 精密度试验

取浓度为9.80 ng/ml对照品溶液按“2.1”项下色谱质谱条件连续进样6次，9-丙烯基腺嘌呤峰面积的RSD为1.72 %（n=6），表明仪器精密度良好。

2.6 溶液稳定性试验

按“2.2”项下制备供试品溶液和对照品溶液，室温下放置，分别于配制后0，1，3，5，8，10，12，24 h按“2.1”项下色谱质谱条件进样测定。结果供试品溶液在24 h内9-丙烯基腺嘌呤峰面积RSD为2.06 %；对照品溶液在24 h内9-丙烯基腺嘌呤峰面积RSD为1.94 %。表明供试品溶液和对照品溶液室温下至少在24 h内稳定。

2.7 检出限和定量限

将9-丙烯基腺嘌呤对照品溶液逐步稀释，进样测定，选取信噪比10倍者作为定量限，信噪比3倍者作为检出限。在进样量为10 μl时，方法的最低定量浓度为0.49 ng/ml，连续测定6次峰面积的相对标准偏差（RSD）为3.1 %，最低检出浓度为0.15 ng/ml。

2.8 重复性试验

取供试品（批号：090706）6份，按“2.2”项下制备供试品溶液，分别测定，按外标法以峰面积计算样品中9-丙烯基腺嘌呤的平均含量为0.000 027 %，RSD为1.96 %。

2.9 加样回收率试验

取已测定9-丙烯基腺嘌呤含量的富马酸替诺福韦二吡呋酯样品（批号：090706）9份，每份20 mg，精密称定，置入10 ml量瓶，分别加入1.6 ml（80 %），2.0 ml（100 %）和2.4 ml（120 %）浓度为50.55 ng/ml 9-丙烯基腺嘌呤贮备液，每个浓度平行制备3份，分别加甲醇稀释至刻度，作为回收率试验溶液，按“2.1”项下色谱质谱条件进样测定，结果平均加样回收率为99.18 %，RSD为2.78 %（n=9）。

2.10 样品测定

取3个批次的富马酸替诺福韦二吡呋酯样品（批号：100310，100318，100326），按“2.2”项下制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱质谱条件进样测定，采用外标法以峰面积计算得9-丙烯基腺嘌呤的含量分别为0.000 034 %、0.000 038 %、0.000 042 %。

3 讨论

2011年USP官网公布的富马酸替诺福韦二吡呋酯质量标准草案，将9-丙烯基腺嘌呤限度定为5 ppm（0.0005 %），由于其在样品中的含量特别低，常规的HPLC法无法检测，需采用LC-MS/MS法进行检测。

本方法质谱条件中，离子检测模式采用MRM，质谱测得杂质9-丙烯基腺嘌呤母离子质荷比m/z为176.1，子离子质荷比m/z为136.1，选择离子对为176.1/136.1。MRM与SIM相比，增加了子离子的测定，使方法灵敏度更高，专属性更强，准确度更高。

实验采用了不同的流速（0.9，1.0，1.1 ml/min），流动相中盐与有机相的不同比例（63:37，65:35，67:33），不同的柱温（27，30，33 ℃）及不同的离子源温度（500，550，600 ℃），结果表明，各色谱质谱条件变动对9-丙烯基腺嘌呤的测定均无显著影响。

方法学验证结果表明：该方法专属性强、准确度好、检测灵敏度高，精密度、线性、稳定性等均能满足测定要求，可用于检测和控制富马酸替诺福韦二吡呋酯中的遗传毒性杂质9-丙烯基腺嘌呤的含量。