正交试验优化马鞭草中马鞭草苷和戟叶马鞭草苷的水提取工艺

刘园园，崔柏宁，李棣华

(1.天津城市职业学院，天津 300250；2.天津中医药大学，天津 301617； 3.天津市南开医院，天津 300100)

马鞭草为马鞭草科植物马鞭草VerbenaofficinalisL.的干燥地上部分，具有活血散瘀、利水、退黄、截疟等功效，可用于治疗癥瘕积聚、痛经经闭、喉痹等症[1-2]。现代研究表明，马鞭草中马鞭草苷和戟叶马鞭草苷具有抗氧化、保肝、保护神经[3]、保护心脏及脑缺血[4]、抗炎[5]等多种作用。马鞭草野生资源丰富[6]，分布地较为广泛，可提取出具有多种功效的生理活性成分。因此，研究从马鞭草中提取马鞭草苷和戟叶马鞭草苷的工艺具有非常重要的价值。

1 仪器与材料

1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；JA3003电子天平 (上海菁海仪器有限公司)；数显恒温水浴锅(金坛市科析仪器有限公司)；DHG-9240A烤箱；KDM型调温电热套(天津市静海县工兴电器厂)；马鞭草苷对照品(南京普仪生物科技有限公司)；戟叶马鞭草苷对照品(南京普仪生物科技有限公司)；娃哈哈纯净水 (杭州娃哈哈集团有限公司)；乙腈 (Fisher公司，色谱级)；磷酸 (TED公司，色谱纯)；其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 马鞭草苷和戟叶马鞭草苷测定方法的建立

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Orca C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；检测波长：240 nm；柱温：30 ℃；流动相：乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B)；梯度洗脱：0～15 min，11%～13% A，15～17 min，13%～24%A，17～20 min，24%～12%A，20～25 min，12%A；体积流量：1 mL/min。

2.1.2 对照品溶液的制备 取马鞭草苷、戟叶马鞭草苷适量，分别精密称定，加甲醇制成含马鞭草苷0.61 mg/mL、戟叶马鞭草苷0.54 mg/mL的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取马鞭草药材粉碎过40目筛，取粉末约0.5 g，精密称定，准确加入蒸馏水25 mL，置具塞锥形瓶中，称定重量，回流提取45 min，冷却至室温，再称定重量，用蒸馏水补足减失的重量，摇匀滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 线性关系考察 分别精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液1、2、5、10、15、20 μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件记录峰面积。以峰面积积分值(Y)对马鞭草苷质量(X)作回归曲线，得回归方程：Y=699.047 6X+258.027 9(R2=0.999 4)，说明马鞭草苷在0.61～12.2 μg范围内线性关系良好；以峰面积积分值 (Y) 对戟叶马鞭草苷质量(X)作回归曲线，得回归方程：Y=481.075 6X+196.254 1(R2=0.999 7)，说明马鞭草苷在0.54～10.8 μg范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度试验 取供试品溶液，连续进样5次，按上述色谱条件测定马鞭草苷和戟叶马鞭草苷的色谱峰峰面积RSD值分别为2.92%和2.33%，表明本方法精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 分别在供试品制备后的0、2、4、6、8 h，精密吸取上述供试品溶液10 μL注入液相色谱仪，分别记录与马鞭草苷、戟叶马鞭草苷对应的标准品保留时间相同的色谱峰峰面积RSD值，分别为2.51%、2.76%。

2.1.7 重复性试验 取同一批样品6份，精密称定，按“2.1.3”项下的方法平行制备，按“2.1.1”项下的色谱条件进样，连续重复进样6次，测得色谱峰的保留时间，计算马鞭草苷、戟叶马鞭草苷含量的RSD值分别为1.94%、2.23%。

2.1.8 加样回收率试验 称取已知含量的样品0.25 g，精密称定，共6份，每份分别精密加入马鞭草苷177.5 μg和戟叶马鞭草苷120.0 μg，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件分别测定与对应的马鞭草苷标准品保留时间相同的色谱峰峰面积，计算加样回收率为96.21%，RSD值为2.84%。同法测定戟叶马鞭草苷的加样回收率为95.74%，RSD值为2.55%。见图1。

注：1.马鞭草苷；2.戟叶马鞭草苷。

2.2 单因素试验

2.2.1 料液比 取马鞭草药材10 g，加入蒸馏水回流提取2 h，提取1次，考察料液比1∶10、1∶12、1∶14、1∶16对提取效果的影响。由表1可知，随着料液比中提取液的增加，马鞭草苷和戟叶马鞭草苷的总量逐渐增加，但料液比越小，提取液越多，越不利于浓缩，因此正交试验选择的料液比是1∶10、1∶12及1∶14。

表1 不同料液比与提取物的含量 (n=2)

2.2.2 提取时间 取马鞭草药材10 g，按料液比1∶14加入蒸馏水回流提取，提取1次，考察提取时间1 h、1.5 h、2 h、2.5 h对提取效果的影响。由表2可知，随着提取时间的延长，马鞭草苷、戟叶马鞭草苷的总量逐渐增加，提取时间对马鞭草苷、戟叶马鞭草苷的含量影响较小，因此选择2 h进行单因素考察。

表2 不同提取时间与提取物的含量 (n=2)

2.2.3 提取次数 取马鞭草药材10 g，按料液比1∶14加入蒸馏水回流提取2 h，考察提取次数1、2、3、4次对提取效果的影响。由表3可知，随着提取时间的延长，马鞭草苷、戟叶马鞭草苷的总量逐渐增加，考虑到经济因素，建议提取次数不要超过3次。

表3 不同提取次数与提取物的含量 (n=2)

2.3 正交试验

根据单因素试验，选取料液比(A)、提取时间(B)及提取次数(C)为三因素设计L9(34)正交试验，正交因素表见表4。

表4 正交试验因素和水平

称取马鞭草10 g，连续称取9份，按照L9(34)正交表的试验条件进行试验，以马鞭草苷、戟叶马鞭草苷的总量为指标，对提取工艺进行优化选择，正交试验设计表及结果见表5、表6。

表5 正交试验设计

表6 方差分析

各因素对提取效果影响：C>A>B。最佳提取工艺：A3B2C3，即料液比为1∶14，每次1.5 h，提取3次。

2.4 验证试验

按上述优选出来的提取工艺A3B2C3，测定马鞭草苷、戟叶马鞭草苷总含量，平行实验的结果为马鞭草苷、戟叶马鞭草苷总含量均值为1.004，表明优选的提取工艺条件符合预期结果，提取工艺稳定可行，正交试验优选方案合理。结果见表7。

表7 验证试验结果

3 结语

自马鞭草中提取的马鞭草苷、戟叶马鞭草苷属于环烯醚萜苷类[7]成分，该类化合物分子量普遍较小，易吸收，且具有多种药用作用[8]，因此马鞭草被认为是一种很有价值的植物药材。本研究利用正交试验方法，优选出马鞭草苷及戟叶马鞭草苷的提取工艺，可为马鞭草的开发和利用提供参考。