水飞蓟宾原料药、利加隆、水林佳大鼠体内药物动力学研究

周旖璇，张纯刚，尹 丽，程 岚

(辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116620)

水飞蓟宾是从菊科植物水飞蓟(SilybumMarianum(L.)Gaertn.)果实中提取的有效成分，是一种具有抗氧化性质的黄酮类化合物[1]。现代药理学表明水飞蓟宾具有抗氧化[2]、保肝[3，6]、抗炎[4]、降血脂[5]、抗癌[6]以及神经保护[7-8]等作用，目前主要应用于肝胆系统疾病的治疗。

由于水飞蓟宾难溶于水、口服吸收差、生物利用度低，其临床应用受到了一定限制，故近年来国内外正积极开发水飞蓟宾新技术新剂型。目前水飞蓟宾相关保肝药物种类较多，如利加隆®、益肝灵片、水飞蓟宾胶囊(水林佳®)和水飞蓟宾葡甲胺片等，都在临床得到广泛应用，对于急慢性肝炎、早期肝硬化、中毒性肝炎、脂肪肝、药物中毒性肝损伤及酒精性肝损害有较好的疗效。本实验建立了快速、灵敏的高效液相色谱法测定大鼠血浆中水飞蓟宾浓度，对水飞蓟宾原料药和市售利加隆®、水林佳®胶囊在大鼠体内的药物动力学进行研究，为水飞蓟宾相关药物的开发提供思路。

1 材料

1.1 仪器

岛津高效液相色谱仪LC-2010A(日本岛津公司)；XH-C漩涡混合器(金坛市白塔新宝仪器厂)；TGL-16G高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；MTN-2800D氮吹浓缩装置(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；HH-2K4四孔恒温水浴锅(巩义市予华仪器有限责任公司)；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)；FA1004精密电子天平(天津天马衡基仪器有限公司)。

1.2 药品与试剂

水飞蓟宾原料药(质量分数98%，上海哈灵生物科技有限公司，批号HLZB0807)；卡马西平对照品(质量分数98%，天津西典化学科技有限公司，批号 C833320)；水飞蓟宾对照品(质量分数98%，上海哈灵生物科技有限公司，批号 110856-201506)；水飞蓟素胶囊(Legalon®)(德国马博士大药厂)；水飞蓟宾胶囊(水林佳®)(天津天士力制药股份有限公司)；β-葡糖醛酸酶(SIGMA公司)；肝素钠注射液(马鞍山丰原制药有限公司)；甲醇(OCEAPAK色谱级。瑞典欧森巴克化学公司)；冰乙酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)；乙酸乙酯(天津市科密欧化学试剂有限公司)。

1.3 动物

健康SD大鼠18只，雄性，体质量(250±20)g，辽宁长生生物技术股份有限公司。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱Agilent Extend C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为A甲醇-B水相=44∶56(水相为水-冰醋酸=52∶1)梯度洗脱；体积流量为1.0 mL/min；进样量50 μL；检测波长为287 nm；柱温为40 ℃。

2.2 溶液制备

2.2.1 水飞蓟宾对照溶液制备 称取水飞蓟宾对照品50 mg于100 mL容量瓶，用甲醇溶解并稀释至刻度，得500 μg/mL的水飞蓟宾对照品储备液。取对照品储备液适量，用甲醇稀释成系列对照品溶液，浓度为100 ng/mL、200 ng/mL、1 000 ng/mL、2 000 ng/mL、5 000 ng/mL、10 000 ng/mL、20 000 ng/mL、100 000 ng/mL，放置在4 ℃条件保存。

2.2.2 内标溶液制备 称取适量卡马西平对照品于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制备成5 μg/mL的内标溶液，放置在4 ℃条件保存。

2.2.3 给药溶液制备 称取水飞蓟宾原料药56.0 mg，用0.5% CMC-Na溶液8 mL混悬，配制成7 mg/mL的给药溶液，放置在4 ℃条件保存。称取含水飞蓟宾56.0 mg的利加隆®(水飞蓟宾含量约为38%)和水林佳®(水飞蓟宾含量约为26%)，用0.5% CMC-Na溶液8 mL混悬，配制得7 mg/mL的给药溶液，放置在4 ℃条件保存。

2.2.4 水飞蓟宾质控(QC)溶液的配制 取适量水飞蓟宾对照品储备液，加甲醇稀释后配制成200 ng/mL、5 000 ng/mL、80 000 ng/mL的质控溶液，放置在4 ℃条件保存。

2.3 血浆样品处理

取大鼠血浆150 μL，加入酶溶液(β-葡糖醛酸酶溶液，酶活性相当于1 000 U/100 μL) 100 μL，涡旋混合1 min，于37 ℃水浴中孵化8 h。取出，加入甲醇15 μL，内标溶液(5 μg/mL卡马西平溶液)15 μL，涡旋震荡1 min，加入乙酸乙酯1 mL，涡旋震荡2 min。12 000 r/min离心10 min，取上清液900 μL，40 ℃下吹干，加入流动相80 μL复溶，涡旋1 min，12 000 r/min离心10 min，取50 μL上清液进样。

2.4 专属性考察

取大鼠空白血浆150 μL，将加入内标溶液15 μL改为加入甲醇15 μL，不加酶溶液，其余按“2.3”项下的方法操作，得到血浆样品A；在空白血浆中加入水飞蓟宾对照品溶液和卡马西平溶液，按“2.3”项下的方法操作，得到血浆样品B；取给药后大鼠血浆样品，按“2.3”项下的方法操作，得到血浆样品C。色谱见图1。

图1 大鼠空白血浆(A)、大鼠空白血浆+对照品(B)和血浆样品(C)HPLC色谱

2.5 方法精密度与准确度

取低、中、高3种不同浓度的质控溶液(200 ng/mL、5 000 ng/mL、80 000 ng/mL)，不加酶溶液和甲醇，按“2.3”项下方法操作，按“2.1”项条件进样测定。每个浓度样品测定6次，连续测定3天，计算日内精密度、日间精密度和准确度。

2.6 提取回收率

取低、中、高3种不同浓度的质控溶液(200 ng/mL、5 000 ng/mL、80 000 ng/mL)，不加酶溶液和甲醇，按“2.3”项下方法操作，按“2.1”项条件进样，记录峰面积结果；另取大鼠空白血浆150 μL，加入甲醇15 μL，涡旋震荡1 min，加入乙酸乙酯1 mL，涡旋震荡2 min，12 000 r/min离心10 min，取900 μL上清液，加入3种不同浓度的质控溶液和内标溶液，40 ℃下吹干，用流动相80 μL复溶，涡旋1 min，12 000 r/min离心10 min，取50 μL上清液进样，记录峰面积结果。通过两种峰面积之比求水飞蓟宾与内标的提取回收率。

2.7 稳定性考察

取低、中、高3种不同浓度的质控溶液(200 ng/mL、5 000 ng/mL、80 000 ng/mL)，不加酶溶液和甲醇，按“2.3”项下方法处理，进样分析，每个浓度制备3份样品，分别考察水飞蓟宾血浆样品室温放置2 h、处理后4 ℃放置24 h、冻融循环1次、冻融循环3次、-20 ℃放置30 d的稳定性。结果见表1。

表1 梯度洗脱程序 (%)

2.8 药物动力学研究方法

将大鼠随机分成3组，每组6只，给药前禁食12 h(不禁水)。第1组灌胃给予水飞蓟宾原料药(给药剂量：25 mg/kg)，第2组灌胃给予利加隆®(给药剂量：25 mg/kg，以水飞蓟宾计)，第3组灌胃给予水林佳®(给药剂量：25 mg/kg，以水飞蓟宾计)，在给药后0.25 h、0.5 h、0.75 h、1 h、1.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h眼眶取血0.5 mL，置肝素化试管中，4 000 r/min离心10 min，取上清液，-20 ℃条件下保存。采用DAS 3.0软件求得主要药动学参数。

3 结果

3.1 水飞蓟宾测定方法学考察

3.1.1 方法专属性 试验结果表明，在上述色谱条件下，药物和内标峰形良好，水飞蓟宾双峰分离效果较好且出峰时间适宜，水飞蓟宾双峰的保留时间分别为8.860 min和9.882 min，内标的保留时间为12.907 min。

3.1.2 标准曲线和定量下限 取空白血浆，加入水飞蓟宾系列标准溶液，制备成10 h、20 h、100 h、200 h、500 h、1 000 h、2 000 h、10 000 ng/mL的标准血浆样品。不加酶溶液，按“2.3” 项下依法处理。以水飞蓟宾质量浓度为横坐标，水飞蓟宾与卡马西平的峰面积之比为纵坐标，求得标准曲线，采用加权最小二乘法进行回归运算，回归方程为Y=0.001 4x+0.036 9，R2=0.998 6(r=0.999 3)，水飞蓟宾在10～10 000 ng/mL范围内线性关系良好，定量下限为10 ng/mL。

3.1.3 精密度和准确度 结果显示，低、中、高3个质量浓度的日内精密度分别为2.42%、1.67%、1.91%(n=6)；日间RSD分别为2.38%、1.89%、1.81%(n=3)，准确度分别为(102.3±2.50)%、(101.6±1.70)%、(100.2±1.75)%(n=6)，符合要求。

3.1.4 提取回收率 低、中、高3个质量浓度的提取回收率分别为84.3%、87.4%、82.3%，(n=3)。内标卡马西平的提取回收率为82.5%(n=3)。

3.1.5 稳定性试验 试验结果表明，血浆样品在上述条件下的RE均在±15%内，结果见表2。

表2 不同贮藏条件下稳定性试验结果

3.2 药物动力学结果

大鼠灌胃给予水飞蓟宾原料药、利加隆和水林佳的平均血药浓度-时间曲线见图2。

图2 水飞蓟宾原料药、利加隆和水林佳大鼠体内血药浓度-时间曲线

将大鼠灌胃给予水飞蓟宾原料药、利加隆和水林佳的血药浓度-时间数据采用DAS 3.0软件处理，药物动力学参数见表3。结果显示，利加隆、水林佳组Cmax分别为(495.3±123.5)ng/mL、(5 895.8±2 487.1)ng/mL，与原料药组相比，药物达峰浓度高，吸收好。原料药、利加隆、水林佳AUC0～12分别为(1 459.0±321.2)ng·h/mL、(5 268.2±681.3)、(8 179.3±1 070.0)ng·h/mL，与原料药组相比，两组市售胶囊均提高了水飞蓟宾生物利用度，相对生物利用度分别为361.0% 和560.6%。

表3 药物动力学参数

4 讨论

水飞蓟宾是以水飞蓟宾A和水飞蓟宾B两种非对映异构体形式存在[9]，在本实验色谱条件下，水飞蓟宾为双峰，分离效果较好，因此以双峰峰面积之和来计算血浆中药物浓度。水飞蓟宾、卡马西平在相同色谱条件下出峰位置合适，且无组分峰影响，故本实验选用卡马西平为内标物[10]。

由于水飞蓟宾在血液中大部分以葡糖醛酸结合型存在，游离型含量很低，为了更准确地考察水飞蓟宾在大鼠体内的生物利用度[11]，实验采用酶解法，测定血浆中水飞蓟宾总含量。采用SIGMAβ-葡糖醛酸糖苷酶(β-Glucuronidase)溶液对血浆样品进行预处理，在确定血浆样品的处理方法过程中，比较了β-葡糖醛酸糖苷酶活性(100 U/100 mL、200 U/100 mL、500 U/100 mL、1 000 U100/mL)及孵化时间(1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h)对血药浓度的影响，最终确定酶解条件为β-葡糖醛酸糖苷酶活性1 000 U/100 mL，37 ℃水浴孵化8 h。

与原料药相比，两种水飞蓟宾胶囊生物利用度提高的原因可能为：利加隆是一种高品质的水飞蓟素制剂，具有高含量、高纯度和高体外溶出度等特点。经特殊工艺提取后，水飞蓟素纯度提高，水溶性增加，溶解度增大，更多药物通过胃肠道黏膜被吸收，从而提高了生物利用度。水林佳是水飞蓟宾与卵磷脂组成的复合物产品，利用固体分散技术提高了水飞蓟宾水溶性和脂溶性，从而提高了生物利用度[12]。这种提高可能与水飞蓟宾一卵磷脂复合物中的磷脂有关，磷脂是细胞膜的重要组成部分，能够保持细胞膜的流动性，从而改善了胃肠道黏膜对药物的吸收。

本实验建立了HPLC法测定大鼠体内水飞蓟宾的血药浓度，进而获得其药物动力学参数。该法简单高效、灵敏度高、特异性强，适用于研究水飞蓟宾在大鼠体内的药物动力学过程。