枳壳药材挥发油的GC—MS指纹图谱研究

刘清茹 谭伟民 文诗泳 肖幸华 陈婷 郭英 曾晓艳 刘塔斯

中图分类号 R927.2 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）04-0461-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.04.08

摘 要 目的：建立枳壳药材挥发油的气相色谱-质谱（GC-MS）指纹图谱。方法：采用GC-MS法，色谱柱为RTX-5MS毛细管柱，进样口温度为250 ℃，载气为高纯氦气（≥99.999%），流速为1.0 mL/min，分流比为10 ∶ 1，进样量为1 μL（程序升温）；采用电子轰击离子源，离子源温度为230 ℃，检测器温度为250 ℃，溶剂延迟时间为3 min，扫描范围为m/z 35～550。以月桂烯为参照，测定21批药材挥发油样品的GC-MS图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004 A版）进行相似度评价，确定共有峰，采用LC Solution 2质谱库（NIST05.LIB和NIST05s.LIB）确定共有峰成分，并采用面积归一化法测定共有峰的相对含量。结果：21批药材挥发油样品的GC-MS图谱有20个共有峰，相似度均>0.90；经验证，21批药材挥发油样品GC-MS图谱与对照指纹图谱具有较好的一致性。枳壳药材挥发油主要成分为柠檬烯、萜品烯、月桂烯和D-Cadinene。结论：所建指纹图谱可为枳壳药材挥发油的真伪鉴别和质量评价提供参考。

关键词 枳壳；挥发油；气相色谱-质谱指纹图谱；道地药材

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish GC-MS fingerprint of volatile oil from Citrus aurantium. METHODS： GC-MS method was adopted. The determination was performed on RTX-5MS capillary column with injector temperature of 250 ℃， high pure helium as carrier gas（≥99.999%）， flow rate of 1.0 mL/min， split ratio of 10 ∶ 1， and sample size of 1 μL （temperature programming）. Mass spectrum condition included electron bombardment ion source， ion source temperature of 230 ℃， detector temperature of 250 ℃， 3 min solvent delay， scanning range of m/z 35-550. GC-MS chromatograms of 21 batches of volatile oil samples were determined using Laurene as reference. The similarity of them was evaluated by using TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System （2004 A edition）， and common peak was determined. The components of common peak were determined by LC Solution 2 mass database （NIST05.LIB and NIST05s.LIB）. Relative content of common peak was determined with area normalization. RESULTS： There were 20 common peaks in GC-MS chromatograms of 21 batches of volatile oil samples， and the similarity was higher than 0.90. After validation， GC-MS chromatograms of 21 batches of volatile oil samples were in good agreement with control fingerprint. The main constituents of the volatile oil of C. aurantium were Limonene，Terpinene， Laurene and D-Cadinene. CONCLUSIONS： Established fingerprint can provide reference for identification and quality evaluation of volatile oil of C. aurantium.

KEYWORDS Citrus aurantium； Volatile oil； GC-MS fingerprint； Genuine regional drug

枳殼为芸香科植物酸橙（Citrus aurantium L.）及其栽培变种的干燥未成熟果实[1]，有理气宽中之功效，多用于食积不化、脘腹胀满等症状[2]。现代药理学研究表明，枳壳具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗溃疡、减少毛细血管脆性等作用[3]。

我国枳壳药材3个道地产区为湖南沅江、江西新干和重庆江津，市场多以药材出处加以区分，分别称为湘枳壳、江枳壳和川枳壳。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性[4-5]。现有研究对枳壳药材的气相色谱-质谱（GC-MS）指纹图谱报道较少，本试验收集了全国不同产地的21批枳壳药材，采用GC-MS法建立了其挥发油指纹图谱，旨在为枳壳药材的鉴别和中成药的质量控制提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

QP2010GC型GC-MS仪（日本Shimadzu公司）；FW- 117型中草药粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；FA- 1604型电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）。

1.2 试剂

试验所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

1.3 药材

枳壳药材购自或采自不同省区（见表 1），经湖南中医药大学药学院刘塔斯教授鉴定为真品（表中，“/”为未知）。

2 方法与结果

2.1 试验条件

2.1.1 GC条件 色谱柱：RTX-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度：250 ℃，载气：高纯氦气（≥99.999%）；流速：1.0 mL/min，分流比为10 ∶ 1，进样量：1 μL。程序升温：初始温度60 ℃，以4 ℃/min速度升至80 ℃；以1 ℃/min速度升至81 ℃，保持4 min；以2 ℃/min速度升至86 ℃；以10 ℃/min速度升至140 ℃；以1 ℃/min速度升至144 ℃，保持2 min；以1 ℃/min速度升至154 ℃；以2 ℃/min速度升至166 ℃；以10 ℃/min速度升至245 ℃；以4 ℃/min速度升至263 ℃。

2.1.2 MS条件 离子源：电子轰击离子源；离子源温度：230 ℃；检测器温度：250 ℃；溶剂延迟时间：3 min；扫描范围： m/z 35～550。

2.2 供试品溶液的制备

取药材样品粉末（过3号筛） 50 g，置于圆底烧瓶中，加水550 mL，浸泡30 min，按2015年版《中国药典》（四部）通则“2204挥发油测定法”甲法提取[6]，提取5 h后，停止加热，放冷1 h，将水缓慢放出，至油层上端到达0刻度线以上 5 mm 处为止。将挥发油以无水硫酸钠脱水，静置过夜，得挥发油粗品，精密量取0.05 mL，加乙酸乙酯定容至5 mL，经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得，冷藏，备用。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取“2.2”项下供试品溶液（编号：S5）适量，按“2.1”项下试验条件连续进样6次测定，以月桂烯峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果，20个共有峰相对保留时间的RSD<1.0%（n=6），相对峰面积的RSD<0.5%（n=6），表明方法精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取“2.2”项下供试品溶液（编号：S5）适量，分别于放置0、2、6、8、12、24 h时进样测定，以月桂烯峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果，20个共有峰相对保留时间的RSD<2.3%（n=6），相对峰面积的RSD<3.0%（n=6），表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.3.3 重复性试验 精密称取同一批药材样品（编号：S5）适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下试验条件进样测定，以月桂烯峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果，20个共有峰相对保留时间的RSD<1.9%（n=6），相对峰面积的RSD<1.6%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.4 GC-MS指纹图谱的生成及相似度、共有峰相关数据分析

2.4.1 GC-MS指纹图谱的生成 取21批药材样品各适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下试验条件进样测定，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004 A 版）对21批药材挥发油样品的GC-MS图谱进行分析，得GC-MS指纹图谱，详见图1[图中，“R”为对照药材（编号：S5）]、图2。

2.4.2 相似度分析 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004 A版）对21批药材挥发油样品的GC-MS图谱进行比较分析，详见表2。结果显示，21批枳壳药材挥发油样品GC-MS图谱的相似度均较好（相似度>0.90），且与对照药材指纹图谱具有较好的一致性，表明各样品间差异较小，质量稳定性良好。

2.4.3 共有峰相关数据分析 对图2进行分析，结果共确定20个共有峰（保留时间见表3）。其中，4号峰为月桂烯，为所有样品共有。因此，以其为参照峰，计算其他共有峰相对于4号峰的相对峰面积，详见表4。

2.4.4 共有峰成分的鉴定 由图2、表3、表4可得20个共有峰相关数据，通过检索LC Solution 2工作站标准质谱图库（NIST05.LIB和NIST05s.LIB）对比相关图谱，及对比相关文献资料[7-9]，鉴定出月桂烯、柠檬烯、萜品烯等20个共有峰成分，详见表5。

2.4.5 不同产地药材挥发油样品GC-MS图谱共有峰成分相对含量比较 取不同产地药材挥发油样品各适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下试验条件进样测定，得 GC-MS图谱，采用峰面积归一化法对其进行积分，得各共有峰成分相对含量，详见表6。

3 讨论

本试验对21批枳壳药材挥发油样品进行了GC-MS分析，通过指纹图谱相似度评价系统，发现21批样品的相似度均较好，但仍可以看出湘枳壳与江枳壳药材挥发油样品相似度更高，说明地缘关系比较近，枳壳药材挥发油样品相对比较稳定，变异较小。

通过对湘枳壳药材（沅江市S5、安仁县S8、盒杉乡S20）挥发油样品共有峰成分相對含量比较，发现沅江市产枳壳药材的挥发油样品中间异丙基甲苯、罗勒烯、萜品烯、蒈烯、4-萜烯醇、α-松油醇、α-萜品烯、二十五烷、1-石竹烯、D-Cadinene、亚油酸甲酯、（-）-β-Elemene相对含量较高；安仁县产枳壳药材挥发油样品中月桂烯、β-蒎烯、α-蒎烯相对含量较高；盒杉乡产枳壳药材挥发油样品中柠檬烯相对含量最高，但其他成分相对含量较沅江市和安仁县低。结果表明，沅江市产区是湘枳壳药材道地产区，有400多年栽培历史，挥发油种类较多且含量相对较高，药材较大，气味醇浓。

通过对不同产地枳壳药材（安徽S2、海南S4、湖南S5、重庆S9、陕西S14、江西S16）挥发油样品共有峰成分相对含量比较，发现湘枳壳、江枳壳药材挥发油样品中月桂烯、柠檬烯相对含量较高；川枳殼药材挥发油样品中β-蒎烯相对含量较高；而安徽产枳壳药材挥发油样品中间异丙基甲苯、D-Cadinene、（-）-β-Elemene、1-石竹烯、亚油酸甲酯相对含量较高；海南产枳壳药材挥发油样品中α-萜品烯相对含量较高；陕西产枳壳药材挥发油样品中萜品烯、反-α，α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化-2-呋喃甲醇、蒈烯、α-松油醇相对含量较高。

通过对饮片（S2）、药材（S5）与炮制药材（S13）共有峰成分含量比较，发现枳壳饮片挥发油样品中间异丙基甲苯、D-Cadinene、（-）-β-Elemene、1-石竹烯、亚油酸甲酯相对含量较枳壳药材和炮制药材挥发油样品高；分析原因可能是饮片经过切片干燥后，主要成分柠檬烯挥发丢失，使得其他成分的相对含量增加；炮制品比未炮制药材挥发油样品中β-蒎烯、α-蒎烯、α-水芹烯、柠檬烯相对含量高，分析原因可能是药材经炮制后烯类成分增加。

枳壳药材挥发油主要成分为柠檬烯、萜品烯、月桂烯和D-Cadinene。湘枳壳、江枳壳品质较佳，主要原因为其主要活性成分柠檬烯较其他产地含量高。

综上所述，所建指纹图谱可为枳壳药材的真伪鉴别和质量评价提供参考。

参考文献

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[ 6 ] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典：四部[S]. 2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：203.

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（收稿日期：2017-04-28 修回日期：2017-07-01）

（编辑：张 静）