枳壳分子生药鉴别DNA片段筛选

张鑫+廖亮+李同建+徐玲玲+韩兴杰+张寿文

摘要：设计特异性引物，对22份枳壳样本进行扩增、测序，利用Genious软件进行序列比对与人工校正，并查找低拷贝序列和ITS序列的杂合位点，利用Mega5.0软件构建叶绿体序列进化系统树。结果表明：acc1基因和ITS序列杂合率高，无法成功鉴别枳壳品种，叶绿体基因可以鉴别枳壳正品与伪品柚；叶绿体基因是枳壳品种鉴定的重要片段，为枳壳品种的鉴定奠定基础。

关键词：枳壳；鉴别；核基因；ITS；叶绿体基因

中图分类号：S567.01文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）11-0020-06

枳壳为芸香科植物酸橙（CitrusaurantiumL.）及其栽培变种的干燥未成熟果实，枳壳首载于《神农本草经》，宋朝以前所用枳壳的原植物为芸香科枸橘（Poncirustrifoliata），明代原植物演变为芸香科植物酸橙[1]。枳壳栽培历史悠久，并常与柑橘林混交，不断选择产生了许多栽培品种，导致枳壳类药材的来源复杂化。蔡逸平等对枳壳类药材进行了品种整理和产地原植物调查，结果表明柑橘属多种植物的果实在不同地区作枳壳用，酸橙（C.aurantium）及其变种臭橙（C.aurantium‘Xiucheng）、香橙（C.aurantium‘Xiangcheng）、枳橙（C.aurantium×Poncirustrifoliate）分布于长江流域及南方各省，以江西、四川、湖南等省产量最大，还包括香圆枳壳（C.wilsoniiTanaka）、甜橙枳壳[C.sinensis（L.）Osbeck]、红河枳壳（C.hongheensisY.L.D.L）、宜昌枳壳（C.ichangensisSwingle）、蟹橙枳壳（C.junosTanaka）、柚枳壳[C.grandis（L.）Osbeck][2]。由于历史原因和各地用药习惯造成枳壳品种混乱，不法商家趁机掺入伪品，目前市场上主要以柚的未成熟果实充当枳壳[3]，其有效成分含量明显低于枳壳正品，没有达到临床用药的含量标准，造成了市场混乱，所以枳壳药材的基源鉴别很重要。

DNA条形码是近年来生物分类和鉴定的研究热点和方向，该技术不受个体形态和发育阶段的限制，具有独一无二的可重复性，对于在形态上较难鉴定的同属近缘种，可以利用较短的基因保守序列进行种的鉴定[4]。曹晖通过分析6种姜黄属药用植物的trnK基因，发现序列可变区包括matK基因编码区和trnK外显子与matK内含子之间的区域，共有6个单核苷酸多态（SNPs）位点、1个9bp的缺失重复序列和4、14bp插入重复序列，它们可以作为6种川产姜黄属药用植物的分子鉴定标记[5]。高建平等应用ITS序列比较了不同产地南五味子的基源植物华中五味子及混淆品绿叶五味子的差异及其规律，认为ITS序列可作为中药南五味子与混淆品绿叶五味子良好的分子标记[6]。基因组中含有丰富的遗传信息，运用核基因序列或叶绿体基因序列鉴定药用植物及生药，已成为分子生药学领域的发展趋势。本研究选取不同来源、不同类型的枳壳样本22份，对15个低拷贝核基因序列、ITS序列、叶绿体基因进行筛选，以期获得可以鉴别枳壳品种的DNA片段，并根据枳壳品种特征选取可以用于快速鉴定枳壳的分子标记方法。

1材料与方法

1.1材料

供试材料采集于江西省、湖南省、四川省三大枳壳产区。采集新鲜完整的嫩叶，用硅胶迅速干燥，于-80℃保存。22份试验材料见表1。

1.2方法

1.2.1DNA提取用改良的CTAB法[7]提取DNA，于-20℃冰箱保存。

1.2.2引物设计与筛选

选取系统发育分析中常用的15个低拷贝序列，从甜橙全基因组中获取以上低拷贝序列全长，设计48对引物，扩增以上序列内含子区域，以新干界埠的臭橙为DNA模板扩增，与甜橙对应序列进行比对，验证为同源序列并确定突变速率后，选取2个片段对22份样品进行扩增，检测其变异速率，验证片段的可用性。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，具体引物信息如表2。

1.2.3扩增与测序

PCR反应体系60μL：1×buffer，250μmol/LMgCl2，200μmol/LdNTP，3UTaqDNA聚合酶，2μLDNA模板，正向引物、反向引物各0.5μmol/L。反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火（退火温度由引物序列决定）30s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸5min，10℃保存。扩增产物送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.2.4数据处理

利用Geneious软件评价测序结果的序列质量，将正向序列、反向序列进行拼接，去除两端质量较差的片段。同时使用该软件的Findhybridizationsite功能查找低拷贝序列和ITS中的杂合位点，统计结果。将叶绿体基因psbA-trnH和trnL-F拼接，利用ClustalW软件对已整理的序列进行比对，利用Mega5.0软件的邻接法（NJtree）构建22个枳壳样本的系统树，自展次数（bootstrap）为1000，其他参数设为默认值。

2结果与分析

2.148个扩增片段测序统计

测序结果显示，acc1、ITS序列、叶绿体psbA-trnH和trnL-F序列扩增成功，其他核基因片段虽能扩增成功，但测序叠峰较多，序列判读困难。

2.2acc1基因序列分析

由表3可见，acc1-1片段扩增长度为620～621bp，有34个突变位点，其中杂合位点有32个，杂合率高达97%，信息位点6个，变异位点占总序列长度的5.5%，信息位点占1.0%。由表4可见，acc1-2扩增片段长度为476～498bp，有12个突变位点，5个信息位点。

2.3ITS序列分析

ITS的扩增片段长度为464bp，共9个突变位点（表5），全部含有杂合位点，变异位点占总长度的2.0%；信息位点8个，占总长度的1.7%。ITS1长度为150bp，其中含有4个杂合位点，5.8S长度为165bp，没有发生突变，ITS2长度为149bp，含有5个杂合位点。

2.4叶绿体片段序列分析

PsbA-trnH的扩增长度为415～419bp，有12个突变位点，10个信息位点，变异位点占总长度的2.9%，信息位点占总长度的2.4%。在166～173bp出现了ATGCCACT碱基的缺失，在296～297bp出现AA碱基的缺失。trnL-F片段的扩增长度为921～928bp，有3个突变位点，在301～306bp

处出现了GAAAAA碱基的缺失，在378～384bp处出现了AATCATT碱基的缺失。从图1聚类结果可以看出，22个样本主要聚为2支，A支为酸橙，B支为甜橙，C支为枳壳伪品柚。

3结论与讨论

3.1测序产生叠峰的原因

扩增的48个片段中测序正常的只有acc1-1、acc1-2、ITS、psbA-trnH、trnL-F等5个片段，其他核基因测序叠峰过多的原因可以归纳为2个方面：（1）选取的低拷贝基因在其他类群中虽然为低拷贝序列，但在枳壳中可能不是低拷贝；（2）枳壳是栽培果树，种群杂合度高，这与栽培品种选育过程中的定向高度选择有关[8-9]，扩增产物杂合性较高导致测序失败，通过挑取单克隆可以正常测序，但由于其来源复杂，不适用于中药材的快速鉴定。

3.2acc1核基因序列的特征

只有7、18号样本的acc1基因为纯合，其他样本都含有杂合位点，表明acc1基因可能为单拷贝基因。Gornicki等研究发现，六倍体小麦质体Accase基因（acc1）为单拷贝核基因，被定位在染色体短臂普通小麦第二同源群上[10]，acc1基因的染色体定位、基因专一性及其在绝大多数禾本科植物中都是单拷贝的[11-12]。单拷贝基因出现较多的杂合位点，可能与枳壳品种本身的杂合程度较高有关，高度的杂合性导致低拷贝核基因叠峰较多，测序困难，因此单拷贝核基因可能不适

用于枳壳品种的鉴定。

3.3ITS序列特征

ITS的长度和序列变化较大，常用于物种鉴定和系统进化研究[13]。ITS为串联重复序列，研究时必须考虑这些拷贝在基因组内的变异，但其存在一致性进化的特征，使整个基因组内所有拷贝趋于均一化，而且这种均一化似乎在大多数物种中相当有代表性。相对于ITS2而言，ITS1序列较长，演化速率较快，种内变异较大，ITS2和5.8S比较保守[14]。Chen等测试了ITS2对药用植物的鉴定能力，建议ITS2作为药用植物鉴定的标准条形码序列[15]。ITS2更适用于药材和标本等DNA已部分降解的样品鉴定，ITS2序列变异较大，并且具备二级结构，为鉴别物种提供独特的分子形态特征。但本研究显示，ITS共有9个突变位点，但全部含有杂合位点，表明序列的杂合性很高，可能与枳壳频繁的自然杂交或人为的杂交育种有关。枳壳生命周期长，嫁接及无融合生殖等无性繁殖方式使得一致性进化速度较慢，杂合位点长期存在于基因组中，因此ITS序列不适合被应用于枳壳品种的鉴定。

3.4叶绿体基因的扩增

与核基因序列相比，叶绿体基因组DNA具有分子量小、拷贝数量多、结构简单等特点，这些都有利于对叶绿体基因组进行分析[16]。叶绿体基因组保守性较强，含有特征性的重复顺序，它的遗传方式多以母系遗传为主，具有单亲遗传特点，不受物种杂合性影响[17]。由psbA-trnH、trnL-F聚类图可知，不同产区的22个枳壳样品主要分为A、B2支，其中A支由酸橙组成，自展支持率为80%，B支由甜橙组成，C支为市场上常用的伪品柚，从图1中能区分开枳壳的伪品与正品。psbA-trnH位于编码光合系统Ⅱ反应中心的D1蛋白的psbA基因和编码tRNA组氨酸的trnH基因之间，被认为是被子植物叶绿体基因组中变异位点最多的序列之一，由于psbA-trnH、trnL-F基因的非编码区受外界选择压力小，进化速率较快，因此已被广泛应用于药用植物种间的鉴别研究[18-19]。本研究表明，叶绿体基因可以区别枳壳及其伪品柚，据报道，叶绿体基因同样成功地鉴别了其他药用植物，如Yang等对大黄属13个种、26个居群、49个样本的trnL-F间隔区的序列进行了测定和分析，找出了大黄属植物该段序列的变异特征，根据分析结果设计了大黄特异性引物，用于鉴别大黄，结果理想[18]。Han等应用psbA-trnH序列成功鉴定了肉苁蓉及其伪品[20]。这些研究结果为实现药用植物品种的分子鉴别奠定了基础。本研究通过将psbA-trnH、trnL-F这2个片段序列用于枳壳品种的鉴定，为中药材的鉴定提供分子方面的证据，以期更好地保证中药材质量。

3.5结论

本研究用acc1等15个低拷贝核基因序列、ITS序列、叶绿体基因对22个枳壳样本进行扩增，测序正常的只有acc1-1、acc1-2、ITS序列、psbA-trnH序列、trnL-F序列，结果表明acc1等低拷贝核基因序列和ITS序列都不适用于药用植物枳壳的品种鉴别，原因可能是枳壳频繁杂交导致的杂合位点长期存在于基因组中，然而叶绿体的psbA-trnH、trnL-F序列不受杂交影响，可以把伪品与枳壳正品区分开，但有些分支的支持度较低，在以后研究中可以使用多个叶绿体片段组合对枳壳的遗传关系进行更准确的研究。虽然本研究筛选的以上序列无法鉴定枳壳品种来源，但psbA-trnH、trnL-F这2个叶绿体基因间隔区可以将甜橙、酸橙及柚区分开，为利用分子标记技术鉴别枳壳品种及辨伪工作奠定了基础。

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