人工种植与道地野生金莲花多糖含量比较及微波辅助提取工艺研究

摘要：在微波辐射下，用水提醇沉法提取金莲花多糖，Seavg法除去蛋白，苯酚-硫酸法测定金莲花中多糖含量；通过单因素和正交试验，探索微波辅助下多糖提取的最佳工艺，并测定比较人工种植与道地野生金莲花中的多糖含量，对人工种植金莲花的药用品质进行评价。结果表明，人工种植金莲花多糖含量为2.53%，最佳提取工艺条件为微波功率400W、料液比1∶20、微波辐射时间30min、浸泡时间60min；人工种植金莲花多糖含量较高，完全可满足药用。

关键词：人工种植；金莲花；多糖；提取工艺；药用品质；评价

中图分类号：O657.32；R284.2文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0332-02

植物多糖具有免疫调节、抗衰老、抗肿瘤、抗凝血和降血糖等作用，可作为治疗疾病的药物和保健食品。植物多糖来源广泛，毒副作用低，安全性好，无致癌作用[1-2]。金莲花为毛茛科植物金莲花（TrolliuschinensisBunge）的干燥花及其花蕾，味苦、性寒、无毒，可治口疮喉肿、浮热牙宣、耳疼目痛[3]。现代药理研究表明，金莲花具有抗菌、抗病毒等活性，用于治疗慢性扁桃体炎、感冒、发烧、急性鼓膜炎、尿路感染等其他炎症。文献报道，金莲花中主要含有黄酮类、有机酸、糖类、蛋白质等[4]。目前，对金莲花的开发研究多限于野生金莲花蛋白质、黄酮类、有机酸类化合物的提取分离和药理活性研究[5-9]，而对人工种植金莲花多糖的提取分离报道不多。随着市场需求量的不断增加，野生金莲花已远远不能满足消费者需求，近年来，各地广泛进行人工种植金莲花。试验通过测定宁夏回族自治区隆德西北中药材有限公司人工种植的金莲花多糖含量，并与野生金莲花多糖含量进行比较，判断其药用价值，为人工种植金莲花的广泛应用提供科学依据。

1材料与方法

1.1试材与前期处理

人工种植金莲花采自宁夏回族自治区隆德县西北中药材有限责任公司种植基地；山西五台山、河北承德、长白山、内蒙古赤峰的野生金莲花购买于宁夏明德中药饮片有限公司，由注册药剂师赵建军鉴定。将试材放入恒温箱中，60℃烘干至恒质量，取出自然阴干、粉碎，过80目筛，依次用石油醚、丙酮处理2次，除去脂类和色素，再用80%乙醇处理2次，除去单糖、低聚糖苷类等物质，干燥至恒定质量，备用。

1.2主要仪器与试剂

UV-2450型紫外可见分光光度计，日本岛津公司生产；FW-177型中草药粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司生产；XH-300A微波催化合成/萃取仪，北京祥鹄科技发展有限公司生产；pHs-2C型精密酸度计，上海雷磁仪器厂生产；RE-52A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂生产；L-S电子天平，精度0.1mg，梅特勒-托利多仪器公司生产。苯酚、98%H2SO4、NaOH、葡萄糖、无水乙醇、CHCl3、正丁醇等，均为国内产分析纯（AR）；水为纯净水。

1.3试验方法

1.3.1标准曲线的建立取适量葡萄糖于烘箱内，105℃烘干至恒定质量[10]；精确称取10mg葡萄糖，加纯水溶解并定容到100mL，配制成0.1mg/mL的标准溶液；分别移取标准液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL于25mL具塞刻度试管中，以纯水补至2.0mL，顺序加入5%苯酚溶液1.0mL和浓硫酸5.0mL，振摇均匀，静置20min；以试剂空白为参比，在波长490nm处测定吸光度。以吸光度为横坐标（D）、葡萄糖含量为纵坐标（C），获得标准曲线方程为C=0.0833D-0.00067（r=0.9993），葡萄糖标准品在0.01～0.16mg/mL之间，与吸光度具有良好的线性关系。

1.3.2金莲花多糖的提取准确称取预处理的金莲花样品1.00g，加适量纯净水于50℃浸泡，按不同液料比、微波功率、微波辐射时间和浸泡时间等条件进行微波提取，以4000r/min离心15min，取上清液；将滤渣在同样条件下再浸提1次，合并2次所得滤液，减压浓缩；向浓缩液中加入1/4倍体积的氯仿-正丁醇（V∶V=4∶1），混合20min，3500r/min离心10min，取上清液，重复5～6次，至中间无明显沉淀为止；将上清液转移到100mL容量瓶中，用纯水定容至刻度，作为供试样品溶液。

1.3.3多糖含量的测定取样品液0.1mL，置于25mL容量瓶中，按照制作标准曲线溶液的方法配制样品溶液并定容至25mL，用UV-2450型紫外可见光分光光度计测定波长490nm处吸光度，计算多糖提取量和多糖含量，计算公式为：多糖提取量（g/mL）=多糖质量浓度（mg/mL）×10-3×稀释倍数；多糖含量（%）=多糖提取量×100/金莲花样品质量。

1.3.4提取工艺研究分别考察液料比、微波辐射时间、微波功率和浸泡时间4个因素对多糖提取的影响；采用4因素3水平正交试验，对提取过程中液料比（A）、微波功率（B）、微波辐射时间（C）和浸泡时间（D）进行优化工艺研究。

2结果与分析

2.1单因素对金莲花多糖提取的影响

2.1.1料液比对多糖提取的影响称取预处理人工种植金莲花1.00g各5份，分别取料液比（g∶mL）为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，固定微波功率400W、浸泡时间60min、微波辐射时间30min进行多糖提取。结果表明，多糖提取率开始随料液比的增大而增加，当料液比大于1∶20时，随着料液比的增大，多糖提取率反而逐渐减小；料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30时，多糖提取率依次为1.21%、1.29%、1.41%、1.39%、1.36%。这是因为随液料比增大，溶剂与原料接触充分，二者的传质作用增强，多糖的提取率增大；当液料比大于1∶20时，随料液比增大，微波功率相同条件下，提取液温度呈下降趋势，致使多糖提取得率反而下降。因此，确定金莲花多糖提取适宜的液料比为1∶20。endprint

2.1.2微波功率对多糖提取的影响称取预处理人工种植金莲花1.00g各5份，固定微波辐射时间30min、液料比1∶20、浸泡时间60min，超声功率分别为300、350、400、450、500W进行多糖提取。结果表明，随微波功率增大，多糖提取率增大，当功率超过400W时，多糖提取率增大趋于缓慢；功率分别为300、350、400、450、500W时，多糖提取率分别为1.19%、1.46%、1.78%、1.79%、1.81%。这可能是因为随着微波功率增大，物系升温加快，固液传质速度加快，对细胞破坏作用增大，有利于多糖浸出，但功率过高，瞬间加热作用会使液体沸腾溢出。为节省能源，微波功率选取400W为宜。

2.1.3微波辐射时间对多糖提取的影响称取预处理人工种植金莲花1.00g各5份，固定微波辐射功率400W、液料比1∶20、浸泡时间60min，微波辐射时间分别为10、20、30、40、50min进行多糖提取。结果表明，多糖提取率初始随微波辐射时间的延长而增加，微波辐射时间在30min时，提取率最高，当辐射时间大于30min时，多糖提取率反而下降；微波辐射时间分别为10、20、30、40、50min时，多糖提取率分别为1.39%、1.42%、1.53%、1.51%、1.48%。这可能是因为多糖热稳定性较差，随微波辐射时间延长，部分多糖变性，使多糖提取率降低。因此，确定适宜的微波辐射时间为30min。

2.1.4浸泡时间对多糖提取的影响称取预处理人工种植金莲花1.00g各5份，固定微波辐射功率400W、液料比1∶20、微波辐射时间30min，浸泡时间分别是20、40、60、80、100min进行多糖提取。结果表明，多糖提取率随浸泡时间的延长而增加，但当浸泡时间大于60min时，随浸泡时间的延长，提取率增大明显趋于缓慢；浸泡时间分别是20、40、60、80、100min时，多糖提取率分别为0.73%、1.08%、1.86%、1.87%、1.89%。为节约时间，确定适宜浸泡时间为60min。

2.2多因素正交试验对金莲花多糖提取的影响

根据单因素试验结果，采用3水平4因素L16（34）正交试验设计（表1），确定金莲花多糖提取最优提取工艺。结果由表2可见，影响金莲花多糖提取的主要因素是微波辐射时间，各因素影响大小依次为C>B>D>A，即微波辐射时间>微波辐射功率>浸泡时间>料液比；结合单因素试验结果，确定最佳多糖提取工艺条件为A2B3C2D2，即料液比1g∶20mL、微波功率400W、微波时间30min、浸泡时间60min。

由表3可见，微波辐射下提取金莲花多糖的主要影响因素是微波辐射时间，微波功率、料液比和浸泡时间对多糖的提取无显著影响。因此，提取过程中应严格控制微波辐射时间，浸泡时间可适当缩短。

2.3验证试验

取适量粉碎后的金莲花，在正交试验所得优化提取工艺条件下进行验证试验，得到多糖提取率为2.53%（n=3）。

2.4不同产地金莲花与人工种植金莲花多糖含量比较

金莲花在我国主要分布于河北、山西、内蒙古、新疆、四川、云南、东北、陕西、甘肃、青海等省（区），山西、河北是传统的金莲花道地产地和栽培地[9]。从宁夏明德中药饮片有限公司购买河北承德、山西五台山、内蒙古赤峰、长白山产的野生金莲花，在优化提取工艺条件下进行提取，得到多糖提取率分别为2.71%、2.62%、2.54%、2.48%（n=3），与宁夏隆德人工种植的金莲花多糖提取率没有显著性差异。

3结论

利用直观法分析微波辐射下提取金莲花多糖，影响因素大小依次为微波辐射时间>微波辐射功率>浸泡时间>料液比，金莲花多糖提取最佳工艺条件为料液比1∶20、微波辐射功率400W、微波辐射时间30min、浸泡时间60min。

与河北、山西、内蒙古、长白山产野生金莲花多糖含量比较，宁夏隆德西北中药材有限公司人工种植的金莲花多糖含量与野生差异不大，完全能满足药用。不过，影响金莲花多糖含量的因素比较多，除人工种植与野生栽培方式能引起多糖含量差异之外，可能还与产地气候、采摘时间、土壤养分等因素有关。

参考文献：

[1]LeeBC，BaeJT，PyoHB，etal.BiologicalactivitiesofthepolysaccharidesproducedfromsubmergedcultureoftheediblebasidiomyceteGrifolafrondosa[J].EnzymeandMicrobialTechnology，2003，32（5）：574-581.

[2]DuXJ，ZhangJS，YangY，etal.Purification，chemicalmodificationandimmunostimulatingactivityofpolysaccharidesfromTremellaaurantialbafruitbodies[J].JournalofZhejiangUniversity-ScienceB，2010，11（6）：437-442.，

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[6]朱登祥，安芳，王书华.牡荆苷对人食管癌EC-109细胞生长及凋亡的影响[J].中草药，2012，43（9）：1781-1784.

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[8]梁永锋.金莲花中绿原酸提取工艺的优化及其含量比较[J].湖北农业科学，2013，52（21）：5296-5298，5302.

[9]梁永锋.不同产地野生与人工种植金莲花黄酮含量的比较及提取工艺[J].江苏农业科学，2013，41（9）：253-255.

[10]董钰明，唐兴文，张树江，等.红毛五加多糖的含量测定条件和提取工艺优选[J].中南药学，2006，4（2）：86-88.endprint

2.1.2微波功率对多糖提取的影响称取预处理人工种植金莲花1.00g各5份，固定微波辐射时间30min、液料比1∶20、浸泡时间60min，超声功率分别为300、350、400、450、500W进行多糖提取。结果表明，随微波功率增大，多糖提取率增大，当功率超过400W时，多糖提取率增大趋于缓慢；功率分别为300、350、400、450、500W时，多糖提取率分别为1.19%、1.46%、1.78%、1.79%、1.81%。这可能是因为随着微波功率增大，物系升温加快，固液传质速度加快，对细胞破坏作用增大，有利于多糖浸出，但功率过高，瞬间加热作用会使液体沸腾溢出。为节省能源，微波功率选取400W为宜。

2.1.3微波辐射时间对多糖提取的影响称取预处理人工种植金莲花1.00g各5份，固定微波辐射功率400W、液料比1∶20、浸泡时间60min，微波辐射时间分别为10、20、30、40、50min进行多糖提取。结果表明，多糖提取率初始随微波辐射时间的延长而增加，微波辐射时间在30min时，提取率最高，当辐射时间大于30min时，多糖提取率反而下降；微波辐射时间分别为10、20、30、40、50min时，多糖提取率分别为1.39%、1.42%、1.53%、1.51%、1.48%。这可能是因为多糖热稳定性较差，随微波辐射时间延长，部分多糖变性，使多糖提取率降低。因此，确定适宜的微波辐射时间为30min。

2.1.4浸泡时间对多糖提取的影响称取预处理人工种植金莲花1.00g各5份，固定微波辐射功率400W、液料比1∶20、微波辐射时间30min，浸泡时间分别是20、40、60、80、100min进行多糖提取。结果表明，多糖提取率随浸泡时间的延长而增加，但当浸泡时间大于60min时，随浸泡时间的延长，提取率增大明显趋于缓慢；浸泡时间分别是20、40、60、80、100min时，多糖提取率分别为0.73%、1.08%、1.86%、1.87%、1.89%。为节约时间，确定适宜浸泡时间为60min。

2.2多因素正交试验对金莲花多糖提取的影响

根据单因素试验结果，采用3水平4因素L16（34）正交试验设计（表1），确定金莲花多糖提取最优提取工艺。结果由表2可见，影响金莲花多糖提取的主要因素是微波辐射时间，各因素影响大小依次为C>B>D>A，即微波辐射时间>微波辐射功率>浸泡时间>料液比；结合单因素试验结果，确定最佳多糖提取工艺条件为A2B3C2D2，即料液比1g∶20mL、微波功率400W、微波时间30min、浸泡时间60min。

由表3可见，微波辐射下提取金莲花多糖的主要影响因素是微波辐射时间，微波功率、料液比和浸泡时间对多糖的提取无显著影响。因此，提取过程中应严格控制微波辐射时间，浸泡时间可适当缩短。

2.3验证试验

取适量粉碎后的金莲花，在正交试验所得优化提取工艺条件下进行验证试验，得到多糖提取率为2.53%（n=3）。

2.4不同产地金莲花与人工种植金莲花多糖含量比较

金莲花在我国主要分布于河北、山西、内蒙古、新疆、四川、云南、东北、陕西、甘肃、青海等省（区），山西、河北是传统的金莲花道地产地和栽培地[9]。从宁夏明德中药饮片有限公司购买河北承德、山西五台山、内蒙古赤峰、长白山产的野生金莲花，在优化提取工艺条件下进行提取，得到多糖提取率分别为2.71%、2.62%、2.54%、2.48%（n=3），与宁夏隆德人工种植的金莲花多糖提取率没有显著性差异。

3结论

利用直观法分析微波辐射下提取金莲花多糖，影响因素大小依次为微波辐射时间>微波辐射功率>浸泡时间>料液比，金莲花多糖提取最佳工艺条件为料液比1∶20、微波辐射功率400W、微波辐射时间30min、浸泡时间60min。

与河北、山西、内蒙古、长白山产野生金莲花多糖含量比较，宁夏隆德西北中药材有限公司人工种植的金莲花多糖含量与野生差异不大，完全能满足药用。不过，影响金莲花多糖含量的因素比较多，除人工种植与野生栽培方式能引起多糖含量差异之外，可能还与产地气候、采摘时间、土壤养分等因素有关。

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[9]梁永锋.不同产地野生与人工种植金莲花黄酮含量的比较及提取工艺[J].江苏农业科学，2013，41（9）：253-255.

[10]董钰明，唐兴文，张树江，等.红毛五加多糖的含量测定条件和提取工艺优选[J].中南药学，2006，4（2）：86-88.endprint

2.1.2微波功率对多糖提取的影响称取预处理人工种植金莲花1.00g各5份，固定微波辐射时间30min、液料比1∶20、浸泡时间60min，超声功率分别为300、350、400、450、500W进行多糖提取。结果表明，随微波功率增大，多糖提取率增大，当功率超过400W时，多糖提取率增大趋于缓慢；功率分别为300、350、400、450、500W时，多糖提取率分别为1.19%、1.46%、1.78%、1.79%、1.81%。这可能是因为随着微波功率增大，物系升温加快，固液传质速度加快，对细胞破坏作用增大，有利于多糖浸出，但功率过高，瞬间加热作用会使液体沸腾溢出。为节省能源，微波功率选取400W为宜。

2.1.3微波辐射时间对多糖提取的影响称取预处理人工种植金莲花1.00g各5份，固定微波辐射功率400W、液料比1∶20、浸泡时间60min，微波辐射时间分别为10、20、30、40、50min进行多糖提取。结果表明，多糖提取率初始随微波辐射时间的延长而增加，微波辐射时间在30min时，提取率最高，当辐射时间大于30min时，多糖提取率反而下降；微波辐射时间分别为10、20、30、40、50min时，多糖提取率分别为1.39%、1.42%、1.53%、1.51%、1.48%。这可能是因为多糖热稳定性较差，随微波辐射时间延长，部分多糖变性，使多糖提取率降低。因此，确定适宜的微波辐射时间为30min。

2.1.4浸泡时间对多糖提取的影响称取预处理人工种植金莲花1.00g各5份，固定微波辐射功率400W、液料比1∶20、微波辐射时间30min，浸泡时间分别是20、40、60、80、100min进行多糖提取。结果表明，多糖提取率随浸泡时间的延长而增加，但当浸泡时间大于60min时，随浸泡时间的延长，提取率增大明显趋于缓慢；浸泡时间分别是20、40、60、80、100min时，多糖提取率分别为0.73%、1.08%、1.86%、1.87%、1.89%。为节约时间，确定适宜浸泡时间为60min。

2.2多因素正交试验对金莲花多糖提取的影响

根据单因素试验结果，采用3水平4因素L16（34）正交试验设计（表1），确定金莲花多糖提取最优提取工艺。结果由表2可见，影响金莲花多糖提取的主要因素是微波辐射时间，各因素影响大小依次为C>B>D>A，即微波辐射时间>微波辐射功率>浸泡时间>料液比；结合单因素试验结果，确定最佳多糖提取工艺条件为A2B3C2D2，即料液比1g∶20mL、微波功率400W、微波时间30min、浸泡时间60min。

由表3可见，微波辐射下提取金莲花多糖的主要影响因素是微波辐射时间，微波功率、料液比和浸泡时间对多糖的提取无显著影响。因此，提取过程中应严格控制微波辐射时间，浸泡时间可适当缩短。

2.3验证试验

取适量粉碎后的金莲花，在正交试验所得优化提取工艺条件下进行验证试验，得到多糖提取率为2.53%（n=3）。

2.4不同产地金莲花与人工种植金莲花多糖含量比较

金莲花在我国主要分布于河北、山西、内蒙古、新疆、四川、云南、东北、陕西、甘肃、青海等省（区），山西、河北是传统的金莲花道地产地和栽培地[9]。从宁夏明德中药饮片有限公司购买河北承德、山西五台山、内蒙古赤峰、长白山产的野生金莲花，在优化提取工艺条件下进行提取，得到多糖提取率分别为2.71%、2.62%、2.54%、2.48%（n=3），与宁夏隆德人工种植的金莲花多糖提取率没有显著性差异。

3结论

利用直观法分析微波辐射下提取金莲花多糖，影响因素大小依次为微波辐射时间>微波辐射功率>浸泡时间>料液比，金莲花多糖提取最佳工艺条件为料液比1∶20、微波辐射功率400W、微波辐射时间30min、浸泡时间60min。

与河北、山西、内蒙古、长白山产野生金莲花多糖含量比较，宁夏隆德西北中药材有限公司人工种植的金莲花多糖含量与野生差异不大，完全能满足药用。不过，影响金莲花多糖含量的因素比较多，除人工种植与野生栽培方式能引起多糖含量差异之外，可能还与产地气候、采摘时间、土壤养分等因素有关。

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[10]董钰明，唐兴文，张树江，等.红毛五加多糖的含量测定条件和提取工艺优选[J].中南药学，2006，4（2）：86-88.endprint