面制品添加剂偶氮甲酰胺热处理下转化为氨基脲的研究

黄晓姗，关铭鑫，杭义萍

(华南理工大学 化学与化工学院，广东 广州 510640)

偶氮甲酰胺(ADA)作为一种食品添加剂，因具有增白及提高面制品性能等优势而被广泛应用[1]。据报道，在面制品的加工过程中，偶氮甲酰胺会降解产生氨基脲(SEM)[2-4]，而SEM对动物均具有较强的致癌、致畸性等[5-7]。目前，我国规定ADA的最高添加量为45 mg/kg[8]，而欧盟一些国家禁止使用ADA作为添加剂[6]。“赛百味”事件再次引起了公众对ADA及其降解产物SEM的关注。目前，检测SEM的方法主要有高效液相色谱法[9-10]、毛细管电泳法[11]、表面增强拉曼光谱法[12]和高效液相色谱-质谱联用法[13-15]等。其中高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS/MS)因灵敏度高、选择性强等特点，成为检测SEM的首选方法。Stadler等[4]采用HPLC-MS/MS对SEM进行检测，比较了直接检测SEM与经衍生处理后再检测两种方法，并考察了ADA在160～240 ℃下的降解情况，但未研究不同烘烤时间对ADA降解的影响。日常生活中，人们常采用蒸煮的方式加工面制品，该工艺的温度在100 ℃左右，目前尚无报道对该情况进行讨论。本研究通过模拟蒸煮与烘烤工艺的温度条件，采用HPLC-MS/MS法检测SEM，考察了ADA在热处理下的降解规律，为面制品中添加剂的安全使用提供了参考。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

LC-20 AD XR高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司)；API-4000三重四极杆电喷雾质谱仪(美国AB Sciex公司)；C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，15 μm，澳大利亚SGE Analytical Science公司)；VERTEX70型傅立叶变换红外光谱仪(德国Bruker公司)；烘箱(上海申贤恒温设备厂)；涡旋混匀仪(德国IKA公司)；PHB-3型笔式pH计(上海三信仪表厂)；Milli-Q纯水机(Millipore公司,电阻率≥18 MΩ·cm)。

偶氮甲酰胺(AOA≥99.9%，美国AccuAtandard公司)；氨基脲盐酸盐(SEM·HCl,≥99.0%，德国Dr.Ehrenstorfer公司)；15N213C-氨基脲盐酸盐(15N213C-SEM,≥99.0%，美国Sigma-Aldrich公司)；2-硝基苯甲醛(2-NBA,≥99.0%，美国Sigma公司)；乙酸乙酯(色谱纯，天津福晨化学试剂厂)；甲醇、乙腈(色谱纯，江苏永华化学试剂有限公司)；甲酸(色谱纯，北京Dikma公司)；实验用水为超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1仪器条件液相色谱条件：C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，15 μm)；柱温：40 ℃；样品室温度：15 ℃；进样体积：10 μL；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；流速为0.8 mL/min；梯度洗脱程序：0～1 min，20% B；1～3 min，20%～90%B；3～6 min，90%B；6～6.5 min，90%～10%B；6.5～10 min，10%B。质谱条件：离子源：电喷雾离子源(Electrospray，ESI)；电离模式：正离子模式；扫描方式：多反应监测模式(MRM)；气帘气：25 psi；雾化气：55 psi；辅助加热气：55 psi；离子源电压：5 500 V；衍生物2-硝基苯甲醛缩氨基脲(2-NPSEM)及其内标15N213C-2-硝基苯甲醛缩氨基脲(15N213C-2-NPSEM)的监测离子对(DP)、去簇电压(DP)、入口电压(EP)、碰撞能(CE)、碰撞出口电压(CXP)等参数见表1。

表1 质谱参数Table 1 The parameters of MS

*quantitative ion

1.2.2实验设计称取0.004 5 g ADA置于小坩埚中，选取烘烤时间为30 min，考察不同温度(100、150、175、200、225、250 ℃)对ADA降解规律的影响；选取烘烤温度为200、175、150 ℃，考察不同烘烤时间(10、20、30、40、50 min)对ADA降解规律的影响。

1.2.3样品前处理将烘烤后的ADA溶于水中，定容至100 mL。取1 mL样品溶液置于离心管中，加入50 μL15N213C-SEM溶液(1 mg·L-1)、100 μL 2-NBA溶液(0.1 mol/L)、2 mL 盐酸溶液(0.2 mol/L)，涡旋混匀后置于37 ℃恒温箱中反应16 h。取出冷却至室温，用盐酸溶液(0.2 mol/L)、氢氧化钠溶液(1 mol/L、0.1 mol/L)及磷酸二氢钾溶液(0.3 mol/L)调至pH 7.0～7.5，加入3 mL乙酸乙酯进行萃取，涡旋振荡后吸取上清液，再加入3 mL乙酸乙酯重复萃取1次，合并乙酸乙酯层，于40 ℃下氮气吹干，再用1.00 mL乙腈和0.1%甲酸水溶液(体积比20∶ 80)复溶，经0.22 μm滤膜过滤后装入2 mL棕色小瓶，待测。

图1 SEM衍生物的反应式Fig.1 Formation of SEM derivative

图2 SEM衍生物的质谱图Fig.2 Mass spectrum of SEM derivative

图3 SEM衍生物的定量离子色谱图Fig.3 MRM chromatogram of SEM derivative

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

SEM的分子量为75 g·mol-1，分子量较小，若直接用质谱检测，会因轰击能量过大而碎裂成无特征的碎片离子，导致检测结果较差；且其极性较大，用色谱检测时保留时间很短，不利于检测，所以需将SEM进行衍生处理后再检测。常用的衍生剂有2-(11H-苯[a]咔唑)乙基氯甲酸酯(BCEC-Cl)[9]、芴甲氧乙酰氯(FMOC-Cl)[10]、2-硝基苯甲醛(2-NBA)[13-14]和4-硝基苯甲酰氯(4-NC)[16]，综合考虑衍生剂稳定性及检出限等因素，最终选取2-NBA为SEM的衍生剂，衍生反应如图1所示。该衍生步骤使得在碰撞诱导离解过程中能解离出具有特征性的碎片离子，提高了质谱的灵敏度和选择性。同时，在衍生前加入15N213C-SEM以减小样品处理过程中的损失。

衍生后得到2-NPSEM的二级质谱图见图2。由图可知，子离子m/z192.1和m/z166.1的丰度较强、干扰较小，选其作为监测离子。其中，以丰度最高的子离子m/z166.1作为定量离子，其提取色谱图见图3。

本研究还对衍生温度及萃取pH值进行了讨论，发现衍生温度为37 ℃、萃取pH值为7.0时，方法的检测效果最佳。

2.2 线性范围、检出限、回收率与精密度

配制系列浓度的SEM标准溶液，按“1.2.3”方法进行前处理，在选定的仪器参数下进行测定，以SEM与内标物的峰面积比值与对应的SEM质量浓度制作标准曲线。结果表明，SEM在0.5～100 μg·L-1范围内具有良好的线性关系，相关系数(r)为0.999，按信噪比(S/N)为3计算得其检出限为0.4 μg·L-1。在不同的样品中分别添加10 、20、40 μg·L-1的SEM标准溶液，每个加标样品平行测定6次，得到3个加标水平下SEM的回收率为99.6%～120%，相对标准偏差(RSD)均小于7.6%。

2.3 烘烤样品的分析

同时本研究通过模拟蒸煮与烘烤的温度模式，选取烘烤时间为30 min，采用HPLC-MS/MS检测SEM，考察了ADA在各温度下转化为SEM的规律。结果发现，当温度为100 ℃时，SEM的生成量极少，几乎为0。随着烘烤温度的增加，SEM的生成量明显上升，烘烤温度达到200 ℃时，SEM的生成率最高，为0.094%，随着温度的继续升高，SEM的生成率急剧下降，这可能是因为过高的温度，使得生成的SEM进一步分解。

图4 样品在蒸煮模式与烘烤模式下的定量离子色谱图Fig.4 MRM chromatograms of samples at cooking mode and baking mode

模拟对比了蒸煮模式与烘烤模式下SEM的生成量，100 ℃及200 ℃条件下的定量离子色谱图见图4。由图4可知，在200 ℃下，SEM的生成量明显高于100 ℃，因此，在日常生活中宜采取蒸煮方式加工面制品，从而减少SEM的摄入。

2.3.2烘烤时间对ADA降解的影响一般烘焙面包的温度在200 ℃左右，本研究选择200 ℃为烘烤温度，考察不同烘烤时间对SEM生成率的影响。结果表明，随着烘烤时间的增加，SEM的生成率逐渐上升，在30 min时达到最高，此后，SEM的生成率缓慢下降。同时考虑到煎炸等面制品的加工工艺，本研究也考察了175 ℃及150 ℃温度下，不同烘烤时间对SEM生成率的影响，其变化趋势与200 ℃时相似。

3 结 论

本研究采用HPLC-MS/MS对ADA的降解产物SEM进行检测，同时还通过模拟蒸煮与烘烤工艺的温度条件，采用HPLC-MS/MS检测SEM，并考察了ADA在热处理下的降解规律。研究表明，在热处理条件下，ADA会降解生成SEM，高温时，ADA基本转化完全，同时过高的温度会导致SEM分解，使得生成率下降；此外，过长的烘烤时间也会导致生成率下降。因此，健康生活应该采取温度较低的蒸煮方式。