基于单颗粒气溶胶质谱的人体呼出颗粒物粒径分布与化学成分的分析方法研究

金丹丹，Anthony S.Wexler，陈文年，刘 荔，周 振，李 雪*

(1.暨南大学 大气环境安全与污染控制研究所，广东 广州 510632；2.暨南大学 广东省大气污染在线源解析系统工程技术研究中心，广东 广州 510632；3.美国加州大学戴维斯分校 空气质量研究中心，美国加州 95616；4.香港中文大学 地球系统科学课程，香港 999077；5.丹麦奥尔堡大学 土木工程系，丹麦 奥尔堡 9210)

人体呼出气中除含有已被广泛研究的挥发性有机物外，还含有一定数目的气溶胶颗粒物(0.001～4.644 个/mL)，其来源主要是呼吸过程产生的内源性颗粒物和人体吸入的外源性颗粒物[1-3]。人体呼出气中的内源性气溶胶颗粒物可能由呼吸道气道壁的内衬液(Respiratory tract lining fluids，RTLFs)在气道闭合、张开的过程中产生，其粒径范围主要为亚微米级[3]。内源性颗粒物的化学成分包括含氮的活性物质(硝酸盐、亚硝酸盐、3-硝基酪氨酸、亚硝基硫醇)、花生四烯酸、蛋白质、代谢物等[4]。人体呼出气中的外源性颗粒物与人体所处的暴露环境有关，如铅加工行业工人的呼出颗粒物中检出了钾、铅、锰、铜、锑、镉元素[5-8]。人体呼出气颗粒物(Exhaled breath particles，EBPs)的粒径和化学成分信息可用于疾病诊断[4，9]、环境暴露评价[5]等研究。

目前，检测EBPs粒径的方法主要采用差分电迁移率分析仪(Differential mobility analyzer，DMA)和扫描电迁移率粒径谱仪(Scanning mobility particle sizer，SMPS)[10-11]。EBPs的化学成分则主要通过检测呼出气冷凝液(Exhaled breath condensate，EBC)的化学成分间接获得。呼出气EBC化学成分的分析方法包括电感耦合等离子体光谱、液相色谱、液相色谱-质谱、全反射X射线荧光分析等[4，10，12-13]。但EBPs的化学成分在冷凝过程中可能发生变化；冷凝时会富集呼气中的水，导致样品稀释(EBC含水量约99.9%)，降低了待测物浓度，提高了对方法灵敏度的要求。

尽管单个颗粒物的质量仅为几十fg,远低于现有仪器的检测限，但单个颗粒物中包含了数百万个分子，因此，可以实现单个颗粒物的化学成分分析[14]。单颗粒气溶胶质谱是一种基于质谱技术、可同时检测单个颗粒物的粒径和化学成分的实时质谱分析技术，一般由进样系统、测径系统、电离系统和质量分析系统4部分组成。目前基于SPMS技术的商品仪器有气溶胶飞行时间质谱仪(Aerosol time of flight mass spectrometer，ATOFMS)(测径范围100～3 000 nm)[13，15- 16]和单颗粒气溶胶质谱仪(Single particle aerosol mass spectrometer，SPAMS)(测径范围200～2 000 nm)[17-20]，主要用于大气PM2.5来源解析、大气化学过程(如二次有机气溶胶形成过程和机制、大气气溶胶混合状态)等研究，而在人体EBPs粒径和化学成分研究中的应用尚未见报道。

综上所述，本文初步考察了SPAMS检测人体EBPs粒径分布和化学成分的可行性，尝试解析呼出颗粒物的粒径分布和化学成分中的信息。

1 实验部分

1.1 人体呼气样品采集

采样点在暨南大学大气环境安全超级站(简称“大气超级站”)楼顶的露天平台。大气超级站位于广州市天河区暨南大学图书馆顶层，北纬23.13°，东经113.35°，距地面约40 m。东距华南快速路约350 m，南距黄埔大道(城市主干道)约400 m，西向500 m左右是高约60～80 m的居民住宅楼群，北向750 m为中山大道(城市主干道)。点位周边无工业污染源。

如图1所示，1位29岁的健康女性站立在露天平台上，采用鼻吸、嘴呼的方式，呼吸数次后，将呼出气收集在3-L Tedlar气袋内。吸入气未经颗粒物过滤处理，所以含有大气颗粒物。采样过程中，用铝箔包裹气袋并加热，加热温度为40 ℃(图1)，以避免呼出气中的水汽凝结在气袋内壁。共采集6袋呼出气样品，集满1袋气约需40 s。在使用前，Tedlar气袋用氮气(纯度≥99.999%)反复清洗。Tedlar气袋上装有双阀，在清洗气袋过程中，一个阀接氮气，氮气以一定流速充入气袋，另一个阀排出清洗气，气袋内的气体体积保持在2 L左右，一般清洗5 min。将清洗后的气袋内充满N2，用SPAMS分析，若10 min内检测到的累计颗粒个数<3个，则认为气袋清洗干净，否则重复上述清洗过程。

图1 基于SPAMS的人体EBPs分析装置Fig.1 Schematic of detection of EBPs by using SPAMS

1.2 样品分析

样品采集后立即进行分析。采用Nafion管(MD-700-06F-1，美国博纯有限责任公司)连接气袋出气口和SPAMS进样口，进样流速100 mL/min(图1)。Nafion管的作用是降低呼气湿度，减小样品中水汽对SPAMS电离效率的影响。Nafion管的反吹气是由气瓶提供的干燥空气，流速200 mL/min。样品分析过程中，保持气袋处于40 ℃恒温状态。样品进入仪器前的相对湿度和温度分别为38%～60%和27 ℃。环境空气样品直接进样分析。一般先测环境空气样品，然后采集人体呼出气样品进行SPAMS分析。呼气样品用气袋采集而未直接分析是由于SPAMS的进样流速为100 mL/min，低于人体呼出气流速(健康成人1 min内呼出气体体积为1 000～1 500 mL)，若直接采集，样品利用效率低，志愿者需在仪器前连续呼气15～20 min才能获得足够的颗粒数进行数据分析。

SPAMS(型号0515，广州禾信仪器股份有限公司)检测EBPs的过程为[21-22]：EBPs通过进样小孔(0.1 mm)从大气压环境进入仪器内的真空环境，在空气动力学透镜的作用下聚焦成颗粒束，经过两束相距一定距离的测径激光(532 nm)，EBPs在这两束激光之间的渡越时间，一方面用于计算颗粒的空气动力学直径，另一方面用于触发下一阶段的电离激光(266 nm)；EBPs在电离区中心时，被电离激光电离为带正电荷和负电荷的碎片离子，这些碎片离子由双极飞行时间质量分析器分别检测(图1)。SPAMS的最大检测速度为20 个/s，测径范围为200～2 000 nm，电离效率(电离颗粒数/测径颗粒数)为20%～30%，质量数扫描范围为m/z1～250，质量分辨率为500 FWHM(Full width at half maximum，半峰宽)。

采用与仪器配套的数据分析软件SPAMS_ANALYZE_V1.8.4.1对数据进行分析。根据测径激光测定的飞行时间，通过软件计算获得颗粒的空气动力学直径[21-22]；根据质谱检测到的碎片离子的质荷比，通过软件计算得到各离子的元素组成，并与文献报道的碎片离子进行比对，确认碎片离子的元素组成[10，23-24]。

1.3 SPAMS校准

SPAMS的校准分为粒径校准和质量数校准两部分，分别用以保证检测颗粒物粒径和质量数的准确性，具体操作流程参照仪器使用手册。

粒径校准：通过气溶胶发生器产生标准粒径(200、300、500、720、1 000、1 300、2 000 nm)的聚苯乙烯小球(PSLs)校正粒径检测系统，校准系数R2>0.99。

质量数校准：使用10 mg/mL的NaI标准物质气溶胶校准飞行时间质量分析器。

2 结果与讨论

2.1 EBPs粒径分布初步研究

6袋样品测得的测径颗粒数、电离颗粒数、电离效率、实测体积和颗粒浓度如表1所示。平均电离效率为19.3%，属仪器正常水平。实测体积为2.03～2.39 L，小于采样体积(约3 L)，目的在于避免当气袋中气体含量较少，从气袋抽气时混入室内空气颗粒物，造成干扰。6袋呼出气样品中EBPs数浓度为227～1 043个/L。Almstand 等[10]用颗粒计数装置检测到的人体呼出内源性颗粒数浓度为200～2 000个/L(0.3～0.5 μm)。考虑到本研究检测到的EBPs数浓度包含内源和外源两类颗粒物，因此需进一步分析EBPs中内源性和外源性颗粒物的分布情况，以评估方法的检测效率。

表1 EBPs的测径颗粒数、电离颗粒数、电离效率、实测体积和颗粒浓度 Table 1 Number of particles with diameter measured，number of particles ionized，ionization efficiency and particle concentration of exhaled particles

*NoSizing：number of particles with measured size；NoIonization：number of ionized particles.For these particles，mass spectra were obtained under both positive and negative ion detection modes；ionization efficiency：ratio between NoIonizationand NoSizing；sampling volume is calculated by timing sample flow rate(100 mL/min) with sampling time；CN-EBPs：number concentration of EBPs；CE-EBPs：number concentration of particles in ambient air

逐袋累加颗粒数(表1)，分析粒径分布随总颗粒数的变化，判断获得稳定粒径分布的最少颗粒数，即检出限(Limit of detection，LOD)。在总颗粒数分别为1 212、2 248(通过累加S-1和S-2中测得的颗粒数获得)、2 725(累加S-1、S-2和S-3测得的颗粒数)、4 165(累加S-1、S-2、S-3和S-4测得的颗粒数)、5 798(累加S-1、S-2、S-3、S-4和S-5测得的颗粒数)和8 105(累加S-1、S-2、S-3、S-4、S-5和S-6测得的颗粒数)的情况下，粒径分布特征几乎一致(如图2A)，即EBPs主要分布在200～1 000 nm、峰值出现在460 nm；各粒径段相对颗粒数(Relative particle number，RPN)相关性分析的判定系数R2表明，当总颗粒数为2 725～8 105时，4个R2值为0.993 7～0.998 3,且无显著差异(如图2B)，表明当总颗粒数为2 725时，EBPs的粒径分布特征趋于稳定，因此确定获得具统计意义的粒径分布所需的LOD为2 500个颗粒物，应采集至少10 L呼气样品。RPN是通过比较SPAMS各粒径分析通道测得的颗粒数与整个粒径范围(200～2 000 nm)获得的总颗粒数计算获得。

当呼出气和环境空气样品中总颗粒数分别为8 105(数浓度227～1 043 个/L)和7 516(数浓度1 583～3 847 个/L)(表1)时，EBPs和环境空气颗粒物RPN相关性分析的R2为0.980 5(图3A)，小于EBPs稳定粒径分布间相关性分析的R2(图2，0.993 7～0.998 3)，表明EBPs和环境空气中颗粒物的粒径分布存在差异。通过观察呼出气和环境空气样品中颗粒物的粒径分布，发现在200～300 nm和440～660 nm范围内EBPs的RPN略高于环境空气颗粒物；而在320～420 nm和680～2 000 nm范围内，EBPs的RPN略低于或等于环境空气颗粒物。环境空气颗粒物主要分布在200～1 000 nm(图3B)，而内源性颗粒物的粒径范围主要涵盖50～ 3 000 nm[3]。因此本实验在200～2 000 nm范围内测得的EBPs粒径分布，应该是内源性和外源性颗粒物粒径分布的混合结果，而呼出气与环境空气粒径分布的差异，既有内源性颗粒物的贡献，也有外源性颗粒物在吸入人体后经过体内沉积、吸湿增长等过程，影响了颗粒物再次被呼出时粒径分布的原因。

2.2 EBPs化学成分初步研究

图4 正(Pos.)、负离子(Neg.)检测模式下呼出与吸入空气颗粒物的平均质谱图Fig.4 Average mass spectra of particles under positive(Pos.) and negative(Neg.) ion detection modes

3 结 论