根霉菌的初筛及在中试绵柔型酿酒中的应用

严启梅，陆其刚，沈晓波，贾亚伟，蒲 春，杨 勇

（江苏洋河酒厂股份有限公司，江苏宿迁223800）

根霉的用途很广，我国自古以来就用其制曲、酿酒。根霉菌具有成品质量稳定、用曲量少和原酒出酒率高等特点，其淀粉酶活力很强，多用作糖化菌。宋克伟等[1]从清香大曲和酒醅中分离筛选出1株高糖化酶活力根霉，经鉴定为米根霉，将其制成麸曲，在原大曲酒工艺不变的基础上添加适量的米根霉麸曲强化发酵，大曲与麸曲结合，两者取长补短，提高了出酒率和优质酒率。目前酿酒生产上常用的根霉菌株不多，选择优良、高质量的根霉菌种是关键，为此，从洋河酒厂大曲中筛选出3株根霉菌，从形态特征、糖化特性方面比较，将高糖化能力的根霉菌M1应用于中试绵柔型酿酒生产中，从糖化醅糖化效果、窖内发酵情况、原酒产质量及基酒风味物质等方面进行分析研究，为提升绵柔型白酒品质提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

1.1.1 样品与试剂

样品：大曲，来源于洋河酒厂。

试剂：孟加拉红，葡萄糖、浓盐酸、硫酸铜、次甲基蓝、酒石酸钾钠、氢氧化钠、亚铁氰化钾等均购于国药集团；麸皮，市售。

1.1.2 培养基

筛选培养基：蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.5 g、琼脂15 g、孟加拉红0.033 g、氯霉素0.1 g，加入1 L蒸馏水，搅拌加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌20 min。

PDA培养基：称取200 g马铃薯，洗净、去皮、切成小块，加水煮烂，用4层纱布过滤，加入葡萄糖和琼脂，加热搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000 mL，115℃灭菌20 min。

麸皮固体培养基：麸皮100 g，加水30～50 mL，搅拌均匀后，121℃灭菌20 min。

1.1.3 仪器设备

实验仪器：SW-CJ-1A标准型净化工作台，无锡深蓝科技有限公司；DNP-9162型电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅，YXQ-LS-75S11型，上海博讯实业有限公司；控温水浴锅，南通华泰实验仪器有限公司；种曲机；圆盘；电子天平，AL204型，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；MILLPORE超纯水系统。

1.2 实验方法

1.2.1 检测方法

水分测定：烘箱干燥法。

还原糖测定：斐林试剂法。

糖化力测定：称取相当于5.0 g绝干曲的曲粉，放在250 mL三角瓶中，加水（90-5×水分%）mL，缓冲液10 mL，在30℃水浴中浸泡1 h，每隔15 min搅拌1次。然后用干滤纸过滤，弃去最初5 mL，接收50 mL澄清滤液，备用，得粗酶提取液后进行糖化酶活力的测定。

糖化酶活力定义：1 g干曲在35℃、pH4.6条件下，反应1 h，将可溶性淀粉分解为1 mg葡萄糖所需要的糖化酶量为1个酶活力单位(U/g)。

试饭糖分与试饭酸度的测定参照文献[2]；风味成分分析参照文献[3]。

1.2.2 菌种筛选

稀释涂布法初筛：取5 g大曲，置于已灭菌的50 mL蒸馏水中，搅拌成悬浮液，制成10-1的溶液，然后吸取1 mL于9 mL无菌水试管中振荡混匀，依次梯度稀释，将10-3～10-6的稀释倍数的菌液在分离培养基上进行涂布，30℃下培养2～3 d。通过菌落形态和显微镜观察将不同形态的菌落挑取到PDA平板上，采用平板划线的方法进行纯化，纯化后接种于PDA斜面上进行保存，以进行下一步筛选。

固体培养：PDA斜面保存的种子等量接种到三角瓶麸皮培养基中，30℃下培养2～3 d，期间每隔24 h摇瓶1次。培养结束后，40℃下鼓风烘干。

1.2.3 根霉M1在中试绵柔型酿酒中的应用

在中试车间绵柔型4个小组20个窖池正常开展试验生产，对照组为原小曲生产基酒，跟踪检测糖化醅糖化效果、窖内发酵情况、原酒产质量等。

2 结果与分析

2.1 菌种筛选

从大曲中筛选分离出3株霉菌，分别命名为M1、M2、M3，具体的菌落形态特征见表1和图1，M1为白色、雪花状、菌丝丰满、菌丝间布满孢子；M2浅灰色、棉花状、菌丝紧密成团，肉眼观察不到孢子；M3黑色、平铺在培养基表层、菌丝较短。由图2显微镜下镜检观察，M1、M2、M3有假根、孢子囊梗直接从假根处生出、黑色的孢子囊，依据形态分类鉴定为根霉。

表1 3株菌落形态

2.2 3株菌糖化特性比较

分别将3株根霉进行固体培养，比较麸曲糖化特性，结果见表2。

表2 3株菌曲糖化特性比较

从表2可以直观的看出，M1麸曲的试饭糖分、试饭酸度、糖化力最高。试饭糖分是反映根霉曲质量的指标之一，同等制曲条件下，试饭糖分越高，说明菌株的糖化酶活力高，麸曲质量好。M1麸曲试饭糖分为23.6%，M2和M3麸曲试饭糖分分别为0.54%、1.19%，说明M1菌曲质量最好，试饭酒香味浓郁；M2和M3菌曲试饭可以忽略不计。M2和M3菌曲未检测出试饭酸度，不适合用于酿酒生产，可能曲的酸度主要受菌株本身的产酸性能影响，所以将根霉M1用于中试绵柔型酿酒生产。

图1 3株菌的菌落形态

图2 3株菌的镜检结构

2.3 根霉M1在中试绵柔型酿酒中的应用

将根霉M1制成麸曲应用于中试绵柔型酿酒生产，选取4个小组，20个窖池，检测值为平均值，跟踪检测糖化醅糖化效果、窖内发酵情况及原酒产质量等，对照组为普通小曲。

2.3.1 糖化醅糖化效果（表3）

选取高糖化力的根霉M1可以提高淀粉的利用率，而且根霉还可以产生多种有机酸，对丰满酒体有一定作用。绵柔型白酒生产原料主要为高粱，采用堆积糖化工艺，根霉M1具有边生长边糖化的作用，完成淀粉向还原糖转变过程，可增加糖化醅的酒香味与复合香。由表3可知，试验组糖化醅还原糖和酸度等理化指标较对照组好，尤其是还原糖，比对照组高15%～25%，糖化醅闻香优于对照组，糖化稳定性好。

2.3.2 窖内发酵温度变化

当糖化醅完成糖化后入池封窖，整个发酵的产酒、生香过程处于完全封闭的状态，而对窖内温度的实时监测直观地反映了酒醅发酵状况。窖池中温度的变化是由环境温度（主要是地温）和窖池微生物进行生长代谢时共同作用的结果[4]。

由图3可以看出，窖内发酵温度升温速度正常，5 d左右达到顶温，温度在30～36℃之间，挺火时间6～9 d。发酵初期，酒醅中富含丰富的营养成分和氧气，微生物大量繁殖，尤其以酵母、细菌为主，直至耗尽酒醅中残存的氧气，酵母菌、细菌迅速生长并进入稳定期，开始酒精发酵，酒精发酵是放热过程，且微生物呼吸也产生热量，窖池各层酒醅温度缓慢升高直至顶火，进入稳定期，各种微生物相互制约、相互依存，处于一种动态的平衡状态，窖内温度维持挺火阶段。发酵后期，窖内营养物质的耗尽、酸度和乙醇浓度的增加改变了窖内微生态环境，酵母、细菌等微生物大量死亡，产生的热量随之减少，温度逐渐降低。图3分析发现，窖内上部、中部和下部的酒醅发酵基本遵循“前缓中挺后缓落”的规律。

表3 糖化醅糖化效果比较

图3 窖内发酵温度变化

2.3.3 窖内微生物变化规律

为了详细的了解窖内发酵情况，选取两个窖池定时取样，分析微生物变化规律，结果见图4、图5、图6。

绵柔型酿酒工艺采用堆积糖化工艺，根霉菌完成高粱等淀粉原料的糖化过程，糖分含量升高，入池发酵。发酵前期，营养成分、氧气充足，加之窖内适宜的温度条件（30～36℃之间），霉菌、细菌、酵母大量繁殖，由图4、图5、图6分析可知，发酵10 d左右，霉菌数量呈现下降趋势，到中后期又出现一个回升现象，并逐渐趋于稳定；20 d后细菌、酵母数量急剧下降，发酵后期，窖内营养物质的耗尽、酸度和乙醇浓度的增大改变了窖内微生态环境，霉菌、细菌、酵母等微生物大量死亡，同时，在发酵后期检测出地霉菌，地霉菌是绵柔型酒醅发酵过程中一种常见的优势菌，这对发酵后期绵柔型风味物质的形成具有重要的贡献作用，同时在浓香型酒醅中也检测出地霉菌。

图4 窖内霉菌变化规律

图5 窖内细菌变化规律

图6 窖内酵母变化规律

2.3.4 原粮出酒率（表4）

表4中以普通小曲酒为对照组，根霉M1麸曲发酵作为试验组。通过统计20个窖池的原粮出酒率，试验组比对照组高3.4%，中试试验表明，试验曲M1根霉菌M1麸曲在提高绵柔型白酒出酒率上效果明显。

表4 原粮出酒率

2.3.5 基酒风味成分

利用根霉M1麸曲生产的优质绵柔型基酒风味成分见表5。

表5 基酒风味成分 (mg/100 mL)

经品评根霉M1麸曲生产的优质绵柔型基酒比普通小曲酒在口感上更绵柔、丰满。通过比较基酒风味成分发现，白酒中的呈香、呈味物质决定着白酒的风格和质量，绵柔型白酒具有“高而不烈、低而不寡、绵长而尾净、丰满协调”等特点，源于种类众多的酸、酯、醇、醛等风味物质间的平衡性。酸是白酒中的重要呈味物质，试验组总酸含量比对照组高7%，与其他香味物质共同组成白酒所特有的芳香，同时有机酸能增加酒的口感，减少或消除酒中的杂味。适当的酸使绵柔型酒在“味”上独树一帜，低而不淡、柔而不寡、绵长尾净、丰满协调[5]。己酸乙酯是绵柔型白酒的主要香气风味物质，从表5可以看出，试验组平均值分别比对照组高3.5%。试验组的乙醛、乙缩醛含量与对照组差别不大，适量的醛酮能辅佐酒的放香；高级醇含量，试验组与对照组差别不大，适量的高级醇能衬托酒体的酯香味，使绵柔型白酒具有醇甜感。

3 结论

3.1 通过微生物分离纯化、形态结构、糖化特性等方法，从大曲中分离出1株高糖化能力根霉菌M1，该根霉菌曲的试饭糖分为23.6%，糖化力为1224 U/g。

3.2 将根霉菌M1应用于中试绵柔型酿酒生产中，跟踪检测糖化醅糖化效果，试验组糖化醅还原糖和酸度等理化指标较对照组好，尤其是还原糖，比对照组提高15%～25%，糖化醅闻香复合香味优于对照组；窖内发酵温度升温速度正常，5 d左右达到顶温，温度在30～36℃之间，挺火时间6～9 d，窖内上部、中部和下部酒醅发酵基本遵循“前缓中挺后缓落”的规律；入池发酵，发酵前期霉菌含量在103cfu/g以下，发酵后期20 d左右几乎检测不到霉菌；发酵前期，营养成分、氧气充足，加之窖内适宜的温度条件（30～36℃之间），酵母、细菌大量繁殖，20 d后细菌、酵母数量急剧下降，检测出地霉菌。试验曲M1根霉菌M1麸曲在提高绵柔型白酒出酒率上效果明显；无论从品评还是风味成分的分析，表明根霉M1麸曲生产的基酒质量得到了提高。