非小细胞肺癌患者癌组织表皮生长因子受体基因18～21号外显子的碱基序列突变情况观察

周建平,徐德 ,王代文,程君

(1攀枝花学院医学院,四川攀枝花617000 ； 2攀枝花学院附属医院；3攀枝花市中心医院)

肺癌是当今世界发病率和病死率增长最快，对人类生命威胁最大的恶性肿瘤之一[1]。非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌的85%。NSCLC对化疗相对不敏感。表皮生长因子受体(EGFR)基因的酪氨酸激酶(TK)结构域中的突变与这些癌症对抑制EGFR激酶活性药物的敏感性增加有关。晚期NSCLC患者EGFR突变状态对靶向药物的疗效有预测作用[2]。研究[3]发现，10%～35%的NSCLC患者会出现EGFR药物致敏突变。约10%的高加索NSCLC患者癌组织中存在EGFR药物致敏突变，但东亚人群这一突变比例超过50%[4]。EGFR突变可导致EGFR信号通路被过度活化，最终诱发恶性肿瘤。 因此，对NSCLC患者进行EGFR基因突变检测是开展EGFR靶向治疗的重要前提，快速并准确地检测患者的EGFR突变状态及类型对临床用药至关重要。 攀枝花-西昌地区(攀西地区)位于四川省西南部攀西大裂谷的安宁河平原，是中国西南地区大型钢铁、钒钛冶炼基地，有全国最大的彝族聚居区，具有典型南亚热带河谷气候特征。独特的气候特点、彝汉等多民族杂居、经济欠发达、对外交通相对不便等现状，使得攀西地区NSCLC患者的EGFR基因突变状况可能具有一定的独特性。目前，尚无攀西地区肺癌EGFR基因突变情况的相关报道。2015年1月～2017年5月，我们观察了攀西地区72例NSCLC患者癌组织EGFR基因18～21号外显子的碱基序列突变情况。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取攀枝花市中心医院、攀钢总医院及攀枝花学院附属医院2015年1月～2017年5月间收治的NSCLC患者72例，其中男47例、女25例，年龄38～80岁，其中>61岁者35例、≤61岁者37例，腺癌45例、非腺癌27例，汉族39例、彝族33例。72例患者均行肿瘤切除术，术中保留癌组织，常规中性甲醛液固定、石蜡包埋、切片及HE染色后备用。另选择本院病理科保存的20例非肺癌患者手术切取的正常肺组织标本作为对照。

1.2 癌组织、正常肺组织EGFR基因18～21号外显子碱基序列分析方法

1.2.1 EGFR基因DNA提取 取癌组织、肺组织，5 μm厚切片5～8张，提取基因组DNA。微量紫外分光光度计测量样品DNA的浓度及纯度，合格样品的OD260/OD280值应介于1.7～2.0之间，样品不纯或浓度不足者应重新抽提。所提取DNA保存在-20 ℃冰箱备用。

1.2.2 EGFR基因18～21号外显子碱基序列特异性PCR及产物测序 针对EGFR基因18～21号外显子设计并合成引物。反应条件：95 ℃、2 min；94 ℃、20 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，40个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物纯化后，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。PCR扩增采用的正反向引物序列见表1。

表1 EGFR基因18～21号外显子引物序列

1.3 EGFR基因突变分析方法 EGFR基因外显子标准序列从美国国家生物技术信息中心网站(NCBI， http://www.ncbi.nlm.nih.gov)获取，参考序列编号为NM_005228.4。采用DNAstar分子生物学基本序列分析软件包的MegAlign程序对比EGFR外显子标准序列与所测患者样本序列，分析样本序列的碱基突变。所有碱基突变类型与NCBI的EGFR临床基因突变数据库(ClinVar)进行比对，确定样本突变类型是否为病理性突变，是否对应特定的药物反应类型。

1.4 统计学方法 采用IBM SPSS Statistics 17统计软件进行处理。基因突变情况与性别、年龄、组织学类型、有无吸烟等临床病理特征的相关性分析用χ2检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

20例正常肺部组织中均未检测到EGFR基因18～21号外显子序列携带基因突变。NSCLC癌组织EGFR基因18～21号外显子的碱基突变率58.3%(42/72)，二者比较，P<0.05。72例患者EGFR基因18～21外显子序列中共发现60种碱基突变，总突变数144个。突变类型包括：点突变、缺失突变、插入突变和插入/缺失突变。外显子18突变率8.3%(6/72)，其中点突变4例；外显子19突变率29.2%(21/72)，其中点突变21例、插入/缺失突变13例、病理性突变4例；外显子20突变率37.5%(27/72)，其中点突变9例、缺失突变2例、插入/缺失突变1例、病理性突变1例；外显子21突变率4.2%(3/72)，其中点突变1例、插入突变1例、病理性突变1例。其中外显子18突变4种，其中c.2127A>C 1例、c.2127A>G 3例、c.2127A>T 2例、c.2147A>G 1例；外显子19突变40种，其中c.2189T>A 1 例、c.2198delC 1例、c.2200G>T 1例、c.2211delA 1例、c.2218delA 1例、c.2235G>A 1例、c.2236_2237delGAinsAC 1 例、c.2236G>A 1例、c.2237A>C 1例、c.2238delA 2例、c.2240_2243delTAAGinsCTCC 3例、c.2240T>C 2例、c.2241_2243delAAGinsTCC 1例、c.2242_2243delAGinsCC 3例、c.2243G>C 2例、c.2245G>A 8例、c.2250A>C 5例、c.2252_2259delCATCTCCGinsACAAGGAA 2例、c.2253A>C 1例、c.2257_2259delCCGinsGAA 2例、c.2258C>A 1例、c.2259G>A 2例、c.2261_2264delAGGCinsTACT 3例、c.2261A>T 1例、c.2262delA 1例、c.2263_2264delGCinsCT 1例、c.2263G>C 1例、c.2266A>G 2例、c.2268_2269delCAinsTG 5例、c.2269A>C 1例、c.2269A>G 2 例、c.2270_2274delAGGAAinsTCAGT 1例、c.2270A>T 6例、c.2272_2275delGAAAinsAGTT 2例、c.2272G>A 1例、c.2275A>G 1例、c.2275delA 1例、c.2278_2279delCTinsTG 7例、c.2281_2282delGAinsTT 5例、c.2281G>T 2例；外显子20突变14种，分别为c.2292delC 1例、c.2326C>T 1例、c.2361G>A 23例、c.2374C>G 1例、c.2387G>T 1例、c.2427T>A 1例、c.2431_2432insA 1例、c.2432_2433delCCinsAT 1例、c.2438A>T 1例、c.2440C>A 1例、c.2452T>A 1例、c.2456_2457delTGinsCC 1例、c.2461delA 1例、c.2463C>G 1例；外显子21突变2种，分别为c.2524_2525insC 1例、c.2573T>G 2例。

与ClinVar比对后发现6种癌症病理相关的碱基突变。其中，良性变异1种(c.2361G>A)，突变率31.9%(23/72)；靶向药物敏感型突变1种(c.2830T>G)，突变率2.8%(2/72)；其它致癌相关突变4种。癌症病理相关突变的总体突变率为12.5%(9/72)，其中靶向药物敏感型突变的总体突变率为2.8%(2/72)，其在EGFR突变样本中的比例为4.8%(2/42)，其中外显子21突变c.2573T>G 突变可导致EGFR蛋白Leu858Arg突变，是EGFR靶向治疗敏感型突变，突变率2.8%(2/72)。

相关性分析结果表明，除NSCLC患者年龄与EGFR基因突变率可能有一定相关性(P=0.05)外,性别、吸烟史、组织学类型、民族等因素与EGFR基因突变率均无关(P均>0.05)。

3 讨论

EGFR突变主要发生在EGFR-TK，EGFR-TK的突变是NSCLC的重要癌症驱动因子，抑制EGFR的酪氨酸激酶活性，可以获得显著的抗癌治疗效果[5]。 EGFR的突变主要发生在18～21外显子序列，即酪氨酸激酶结构域的编码序列，其中19和21号外显子突变覆盖EGFR突变的90%。EGFR-TK突变的肺癌患者应用EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)类药物，包括厄洛替尼、吉非替尼和阿法替尼等[6]。EGFR-TKIs的敏感性与EGFR的突变类型密切相关，不同的突变类型可能导致肿瘤对同一靶向药物具有完全不同的反应[6]。最新研究[7]结果表明，EGFR第18、19和21号外显子突变是NSCLC患者对EGFR-TKIs敏感的强关联因子，而第20号外显子突变则是EGFR-TKIs耐药的原因。

本次研究发现，攀西地区NSCLC患者EGFR第18～21外显子基因的总突变率为58.3%。与此前文献[8～10]数据比较发现，本地区EGFR激酶结构域基因的突变率与华南(55/172，32%)、华东(35/118，29.7%)及全国平均(57/176，32.4%)[8, 9]突变率有显著差异，但与相邻的云南宣威(43/81， 53.10%)、昆明(48/86， 55.80%)[10]等地的突变率无显著差异。上述结果表明，攀西地区NSCLC患者EGFR突变率与周边地区突变率一致，但显著区别于全国其他地区，具有较高的EGFR突变率。这种EGFR突变率的地域性差异暗示攀西及周边地区可能具有更高的EGFR诱变因子，对该区域EGFR基因诱变因子的研究可能具有较高的理论价值。

攀西地区NSCLC患者EGFR-TK突变率与患者病理数据的相关性与文献报道存在较多差异。Shigematsu等[11]在617例非小细胞肺癌中检测到130例(21%)共134个EGFR-TK结构域突变，并证明该类型突变为NSCLC所特有，在受检患者中EGFR- TK结构域突变率与患者吸烟史、组织学类型、性别等均有显著的相关性，而与患者年龄无关。与上述结果相比，本次研究中从攀西地区患者中检测到的EGFR-TK结构域的总突变率更高，但突变率与患者的吸烟史、组织学类型、性别无相关性，而与患者年龄有一定的相关性，这与上述研究的结果恰好相反。上述差异与EGFR突变率的地区差异一样，反映出攀西地区具有独特的EGFR诱变因子，EGFR的突变可能与患者种族和生活方式有关[12]，具体原因有待进一步研究。由于样本量的局限，本次研究中EGFR突变率与患者年龄的相关性及其与患者民族的相关性尚缺乏足够的统计学支持，更准确的相关性分析结果有赖于进一步的大样本量分析。

Kobayashi等[13]在79个存在EGFR-TK结构域突变的肿瘤中发现有11个(14%)具有靶向药物敏感型突变，适用靶向药物治疗。本次研究发现，在所有存在EGFR-TK结构域突变的肿瘤中，适用靶向药物的敏感型突变人数仅占总突变人数的4.8%(2/42)，与上述研究结果并无显著差异，说明攀西地区EGFR药物敏感型突变的发生率与其他地区一致，适于将靶向抗癌药物应用于具有特定基因突变的人群。

综上所述，攀西地区NSCLC患者EGFR基因突变率与周边地区一致，但高于全国其他地区。NSCLC癌组织EGFR基因18～21号外显子突变率较高，主要突变类型为点突变、缺失突变、插入突变和插入/缺失突变等。19号外显子基因突变情况最多，20号外显子突变类型最复杂。6种癌症病理相关突变中仅21号外显子中发现1种靶向药物敏感型突变。