腹腔注射黄芪注射液的糖尿病小鼠肾脏组织病理变化观察

黄云芳， 付会玲，张云，刘昌璇 ，贾琳 ，黄敏 ，陈文莉

(1华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院，武汉430014；2武汉市第六人民医院)

近年来，糖尿病发病率逐年升高。糖尿病肾病(DKD)是终末期肾病(ESRD)的主要原因之一。既往研究[1]发现，过度活化的肾素-血管紧张素系统(RAS)在DKD发生、发展中起重要作用。血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素Ⅱ受体阻断剂(ARB)具有控制血压、减少蛋白尿、抑制炎症反应、抗纤维化、靶器官保护等功能，是目前DKD治疗的一线药物[2, 3]。受血钾、血肌酐，肾小球滤过率、肌酐清除率等因素限制，ACEI、ARB类药物无法适用于各阶段DKD的治疗，寻找多元化DKD治疗方案，是目前的DKD研究热点。血管紧张素转化酶是RAAS家族重要成员之一，其水平直接反应RAAS系统活跃程度。高水平血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、RAAS系统的过分活跃诱导淋巴细胞在肾脏异常聚集，产生大量炎症因子，诱发肾脏损伤[4]。最新研究[5、6]发现，黄芪(RA)具有抗氧化应激、降糖、改善水钠潴留、改善代谢功能紊乱等功能，可用于DKD的治疗，但关于黄芪在DKD中的具体机制目前尚不明确。2016年10月～2017年11月，我们观察了腹腔注射黄芪注射液的糖尿病小鼠肾脏组织病理变化，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药物、试剂及仪器 7～8周龄雄性C57BL / 6J小鼠40只，体质量20～25 g(武汉大学动物实验中心),饲养于华中科技大学同济医学院实验动物中心SPF级动物房。黄芪注射液(中国河北神威药业集团有限公司)；贝那普利(常用肾脏保护药物，北京诺华制药公司)。链脲霉素(STZ)(美国Sigma公司)。

1.2 小鼠分组、糖尿病模型制备及黄芪给予方法 将C57小鼠随机分为正常组、糖尿病组、黄芪组、贝那普利组，每组10只。正常对照组小鼠不经任何干预。黄芪组、贝那普利组、糖尿病组制作糖尿病模型(180 mg/kg一次性腹腔注射1%STZ，注射后 48～72 h静脉血糖浓度≥16.7 mmol/L且维持1周以上为造模成功)。造模成功后适应性饲养2周，黄芪组腹腔注射黄芪注射液0.03 mL/10 g,1次/d；贝那普利组予贝那普利灌胃，10 mg/kg,1次/d,糖尿病组小鼠不做任何处理。饲养12周取各组小鼠，从下腔静脉收集小鼠静脉血，2 000 r/min离心15 min，取上层血清，-80 ℃保存备用。向各组小鼠左心室缓慢注入预冷PBS处死各组小鼠，快速取下双侧肾脏，剥离包膜置于预冷PBS。右侧肾脏1/3纵切后放入4%多聚甲醛中常温固定，石蜡包埋，制成4 μm石蜡切片。其余肾脏组织液氮冷冻后保存备用。

1.3 各组肾脏病理情况观察 取各组肾脏组织，固定、脱水、浸蜡、石蜡包埋、切片、62 ℃烤片、脱蜡及水化等处理，PAS染色，染色后镜下观察各组肾脏病理情况。

1.4 各组小鼠肾脏组织、血清AngⅡ检测方法 采用ELISA法。取各组肾脏匀浆及血清，肾脏匀浆5倍稀释、血清2倍稀释。取加样板，每孔各加入标准品或待测样品100 μL，每组6个复孔，充分混匀置于37 ℃温箱40 min，将反应板充分洗涤4～6次，加入蒸馏水和第一抗体工作液各50 μL(空白孔除外)，充分混匀后37 ℃温箱20 min，加入酶标抗体工作液100 μL，37 ℃温箱10 min，洗涤4～6次，加入底物工作液100 μL，37 ℃温箱避光反应15 min，加入100 μL终止液充分混匀，30 min内用酶标仪测定并记录各组450 nm处的光密度OD值，取平均值，以OD值代表相应AngⅡ。

1.5 各组肾脏组织纤维化情况观测 ①采用免疫组化染色法检测各组肾脏组织α-SMA、Collagen-Ⅳ。所有操作均严格按照免疫组化染色试剂盒进行。②采用Masson染色法观察各组肾脏组织纤维化情况。所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。

1.6 各组肾脏组织ACE、ACE2 mRNA及蛋白检测 ①取各组肾脏组织，RIPA裂解液裂解，低温离心取上清，BCA法测定蛋白浓度，裂解液裂解后，煮沸变性混匀，10%SDS-PAGE分离，转膜至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温摇床封闭1 h，5%脱脂奶粉稀释一抗ACE(1∶200)、ACE2(1∶300)和GAPDH(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。次日拿出条带，充分洗涤，对应二抗37 ℃摇床孵育1 h，ECL显色，采集图像，采用Image J 软件分析测算各组肾脏组织ACE、ACE2蛋白的相对表达量。②采用 Real-time PCR法。取各组肾脏组织，提取RNA，用酶标仪测定提取总RNA，1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测其的完整性。采用TOYOBO逆转录试剂盒，反应体系：500 ng总RNA，1 μL Oligo dT和水，总体积12 μL，65 ℃作用5 min。加入4 μL 5 X Reaction BUffer, 1 μL RiboLock RNase Inhibitor(20 μ/μL), 2 μL 10 mmol/L dNTP Mix, 1 μL RevertAid M-Mul V Reverse Transcriptase(200 μ/μL),42 ℃作用1 h，70 ℃作用5 min，-80 ℃保存备用。引物由北京擎科生物技术有限公司合成。ACE上下游引物分别为5′-AGAGTACAACCAGATCCTGCTAGAC-3′；5′-TCCAGC-TCTTCCATGCCCATAG-3′;ACE2上下游引物分别为5′-TGTGTCTGATGTCATTCCTAGAAGTG-3′；5′-AGGC-TGGTAAGGTGGCTCAAG-3′;以GAPDH为内参，上下游引物分别为5′-ACCCCCAATGTATCCGTTGT-3′；5′-TACTCCTTGGAGGCCATGTA-3′。ACE、ACE2相对表达量以2-ΔΔCt表示，实验重复3次，取平均值。

1.7 各组肾脏组织MDA含量检测 采用硫代巴比妥酸法。取各组肾脏组织，具体操作方法参照商业化成品试剂盒(南京建成生物工程研究所制造)说明书。在450 nm波长检测样本，以消除糖基化和其它类脂醛类的部分影响，所有的检测重复3次，MDA含量为每毫克蛋白质的纳摩尔数。

1.8 各组肾脏组织MCP-1、ICAM-1、TGF-β和TNF-α检测 采用 Real-time PCR法。取各组肾脏组织，检测方法同“1.6”。MCP-1上下游引物分别为5′-CTCAGCCAGATGCAGTTAACGCCC-3′；5′-GGTGCTGAAGACCTTAGGGCAGAT-3′；TGF-β上下游引物分别为5′-GGACTCTCCACCTGCAAGAC-3′；5′-GACTGGCGAGCCTTAGTTTG-3′;TNF-α上下游引物分别为5′-GCCTCCCTCTCATCAGTTCT-3′；5′-CACTTGGTGGTTTGCTACGA-3′;ICAM-1上下游引物分别为5′-CGGCATATTACGAGTGTGAATC-3′；5′-ATCCCGATTGGCAGGTATTA-3′;以GAPDH为内参，上下游引物分别为5′-ACCCCCAATGTATCCGTTGT-3′；5′-TACTCCTTGGAGGCCATGTA-3′。每组做3个生物重复，相对表达量以2-ΔΔCt表示。

2 结果

2.1 各组肾脏组织病理变化 与正常对照组小鼠相比，糖尿病小鼠肾脏组织肾小球肥大、系膜基质增多和系膜细胞增生的病理改变，黄芪组小鼠肾脏组织和贝那普利组小鼠肾脏组织肾小球肥大、系膜基质增多和系膜细胞增生情况减轻。

2.2 各组肾脏组织、血清AngⅡ相对表达量比较 各组肾脏组织、血清AngⅡ相对表达量比较见表1。

表1 各组肾脏组织及血清AngⅡ相对表达量比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与糖尿病组比较，#P<0.05。

2.3 各组肾脏组织纤维化情况比较 各组肾脏组织α-SMA、Collagen-Ⅳ相对表达量比较见表2。糖尿病组小鼠肾脏间质胶原沉积较正常对照组小鼠明显增加,黄芪组、贝那普利组肾脏组织胶原沉积量减少。

表2 各组肾脏组织α-SMA、Collagen-Ⅳ相对表达量比较

注： 与正常对照组比较，*P<0.05；与糖尿病组比较，#P<0.05；与贝纳普利组比较，※P<0.05。

2.4 各组肾脏组织ACE、ACE2 mRNA及蛋白相对表达量比较 见表3。

表3 各组肾脏组织ACE、ACE2 mRNA及蛋白相对表达量比较

注： 与正常对照组比较，*P<0.05；与糖尿病组比较，#P<0.05。

2.5 各组肾脏组织MDA含量比较 黄芪组、贝那普利组、糖尿病组、正常对照组肾脏组织MDA含量分别为(41.28±4.02)、(36.46±1.97)、(54.74±2.61)、(36.01±2.91)ng/mL,与正常对照组比较，糖尿病组、黄芪组、贝那普利组肾脏组织MDA含量均升高(P均<0.05)；与糖尿病组比较，贝那普利组肾脏组织MDA含量均降低(P均<0.05)。

2.6 各组肾脏组织MCP-1、ICAM-1、TGF-β和TNF-α mRNA相对表达量比较 见表5。

表5 各组肾脏组织MCP-1、ICAM-1、TGF-β和TNF-α mRNA相对表达量比较

注： 与正常对照组比较，*P<0.05；与糖尿病组比较，#P<0.05。

3 讨论

RAS系统过度活化是促进糖尿病肾病发生及进展的关键机制，尤其是肾脏组织局部的RAS。AngⅡ是最重要的效应分子，AngⅡ与AT1受体结合后可通过多种分子信号机制收缩血管、使反应性活性氧簇(ROS)物质增多,并通过ROS依赖性机制和非ROS依赖性机制造成血管损伤、炎症反应、细胞增殖等[7]，刺激Ⅰ型胶原蛋白及TGF-β合成、进而导致成纤维细胞的分化[8]，最终引起肾脏纤维化及硬化。本研究发现，糖尿病小鼠肾脏组织中AngⅡ浓度明显升高；黄芪和贝那普利均可降低小鼠肾脏中AngⅡ含量,且黄芪和贝那普利组小鼠肾脏中AngⅡ表达差异无统计学意义；而各组血液中AngⅡ浓度均无明显差异。糖尿病小鼠血液中AngⅡ浓度并无增高，仅在肾脏组织局部增加。糖尿病患者血中RAS成分与正常人相似，有时可能更不活跃，推测可能与糖尿病状态下细胞外液过多抑制其活性有关[9]。有研究[10]发现黄芪甲苷可以降低两肾一夹型高血压大鼠肾脏组织AngⅡ的水平，减轻肾脏病理损伤，与本实验相符。

糖尿病肾病的病理改变表现为系膜基质增多、肾小球基底膜增厚、系膜细胞数目增加，Collagen-Ⅳ是 ECM 重要成分，其合成和降解代谢失调可导致肾小球及间质硬化及纤维化，α-平滑肌肌动蛋白，是间质纤维化的一个标志物。本研究结果显示，糖尿病组肾脏组织α-SMA、Collagen-Ⅳ相对表达量明显上升，肾脏间质胶原沉积较正常对照组小鼠明显增加，黄芪干预后，上述指标的含量分别显著减少，而黄芪组小鼠和贝那普利组小鼠上述指标的表达量差异无统计学意义；提示黄芪可以遏制DM小鼠肾脏的纤维化。

RAS系统在炎症和纤维化中起关键作用。实验表明ACEI类药物贝那普利经阻断肾内 RAS 可以缓解TGF-β介导 ECM 积聚引起的肾小球硬化 ,从而延缓肾功能恶化[11]。对糖尿病大鼠的实验研究显示，黄芪可以降低肾脏皮质TGF-β水平，从而减少Ⅳ型胶原的沉积，抑制ECM沉积[12]。

ACE2是对肾脏保护的有益因子，但本研究结果提示，糖尿病组小鼠肾脏ACE2的表达量较非糖尿病组小鼠明显增加,经黄芪干预后，糖尿病小鼠ACE2的表达量反而明显降低，且黄芪组小鼠和贝那普利组小鼠在ACE2表达量方面未见明显差异；而各组小鼠在ACE表达上却呈现相反趋势，即：DM组小鼠的ACE表达量较非糖尿病组小鼠明显减少，经黄芪干预后，上述指标的表达量明显提高，黄芪组和贝那普利组小鼠在ACE表达量上无明显统计学差异。谭宇等[13]给予人肾小管上皮细胞不同浓度的 Ang Ⅱ 刺激并观察ACE 及 ACE2 表达的变化，结果发现Ang Ⅱ可通过ROS上调肾小管上皮细胞内ACE的表达，下调ACE2表达。国外学者[14]在神经细胞中也发现Ang Ⅱ上调ACE表达，下调ACE2表达，遗憾的是，以上研究均为体外实验，且均为高浓度的Ang Ⅱ刺激。

推测本实验结果原因可能为，糖尿病早期ACE2反应性表达增多加强降解Ang Ⅱ发挥积极的保护作用。本实验所测为包含肾小球及肾小管的总的ACE及ACE2，并未区分肾小球区及肾小管区，肾小球及肾小管之间的分布有否差异尚不清楚。本实验仅观察了12周肾脏组织的变化，是否是糖尿病肾病早期的一种代偿机制尚需进一步观察。

MDA是自由基作用于脂质产生过氧化反应的终产物，使蛋白质、核酸等生物大分子交联结合，具有细胞毒性，其含量可提示体内脂质过氧化的速度和强度，丙二醛参与糖尿病肾病的发生与发展[15]。本研究结果显示，糖尿病组小鼠肾脏MDA含量较非糖尿病组小鼠明显增加，经黄芪干预后，MDA含量明显降低，且黄芪组小鼠和贝那普利组小鼠MDA含量未见明显差异。结果表明黄芪可阻遏脂质过氧化反应，与赵莲芳等[16]研究结果一致。

长期葡萄糖代谢异常导致蛋白激酶C(PKC)活性增加，多元醇通路激活，使促纤维化因子(TGF-β和结缔组织生长因子)等分泌显著增加，而TNF-α、TGF-β等各种炎性因子的释放增加，促进胶原蛋白Ⅳ及纤维连接蛋白合成增多，导致肾小球系膜细胞增生，加速肾小球纤维化[17]。ICAM-1即细胞间黏附分子，是介导黏附反应的单链跨膜糖蛋白，其受体为整合素家族的黏附分子-白细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，已发现细胞间黏附分子/白细胞功能相关抗原-1的相互作用在淋巴与内皮细胞的结合及淋巴细胞介导的细胞毒反应过程中具有非常重要的作用，促进肾小球处白细胞的黏附加速，进而导致肾小球的损伤[18]。本实验结果显示，糖尿病组小鼠的MCP-1、TGF-β和TNF-α的表达量增加；黄芪组MCP-1、 TGF-β和TNF-α表达量降低。

综上所述，腹腔注射黄芪注射液的糖尿病小鼠肾脏组织病理改变减轻，其机制可能为黄芪抑制肾素-血管紧张素系统、TGF-β导致的组织纤维化、氧化应激炎症反应。