干扰MiRNA-155表达的寻常型银屑病患者CD4+T细胞分化观察

苏华振,魏明

(郑州大学第五附属医院，郑州450052)

银屑病是一种多基因遗传背景下由T淋巴细胞介导的慢性炎症性皮肤病，CD4+T细胞及多种细胞因子在银屑病的发生、发展中起着重要作用[1]。寻常型银屑病是常见的银屑病类型，近年发病率逐年升高。寻常型银屑病的发病机制十分复杂，遗传、免疫、感染、内分泌等因素均参与了其发病过程。T helper cell 17(Th17)细胞是一种以分泌白介素(IL)-17为主的CD4阳性T淋巴细胞(CD4+T)细胞亚群。研究[2,3]表明，Th17细胞及相关细胞因子参与了寻常型银屑病的发病过程。微小核糖核酸(miRNA)-155是机体正常免疫调节所必需的miRNA分子，可通过不完全碱基互补方式与miRNA相应的区域结合，抑制蛋白质翻译。E26转录因子(Ets)-1是miRNA-155的靶基因[4]，能够调控Th17细胞在内的多种细胞的增殖和分化，参与自身免疫性疾病的发生与发展[5,6]。研究[6]表明，Ets-1缺陷鼠的Th细胞比野生型鼠的Th细胞向Th17细胞分化增多，说明Ets-1是Th17细胞分化的负性调节因子，Ets-l缺陷会导致Th17细胞相关应答的异常。目前关于miRNA-155在寻常型银屑病外周血CD4+T中的表达对Th17细胞的分化的影响及其调控机制尚不清楚。2016年4月～2017年8月，我们观察了抑制miRNA-155对寻常型银屑病患者外周血CD4+T细胞分化的影响，并探讨其可能作用机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年4月～2017年8月间就诊于我院皮肤性病科门诊的寻常型银屑病患者30例，其中男20例、女10例，年龄32.6岁，病程1个月～20年，平均6.8年。均符合《中国临床皮肤病学》[7]的寻常型银屑病诊断标准。排除标准：近2周内局部外用皮质类固醇激素及免疫抑制剂；近1个月系统应用糖皮质激素、阿维A、补骨脂素等系统治疗、紫外线治疗及日光浴；有心脏、肝肾疾病及精神疾病者；有感染、妊娠、分娩、外伤等应激状态；存在各器官恶性肿瘤者。另选择30例健康志愿者为正常对照组，其中男19例、女11例，年龄32.4岁。两组年龄、性别比例等临床资料具有可比性。本研究获医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 试剂及仪器 改良型RPMI 1640培养基(美国Hyclone公司)；淋巴细胞分离液(北京索莱宝科技有限公司)；TRIzol-A+总RNA提取试剂(北京天根生化科技有限公司)；脂质体LipofectamineTM2000(美国Invitrogen公司)；藻红蛋白-青色素染料5(PE-Cy5)标记小鼠抗人CD4单克隆抗体、FITC标记小鼠抗人IL-17A单克隆抗体(美国Biolegend公司)；佛波酯、离子霉素、莫能霉素(美国Sigma公司)；破膜剂(美国BD公司)；人CD4+T细胞分选试剂盒(挪威Dynal公司)；β-肌动蛋白(actin)多克隆抗体(美国Proteintech Group公司)；IL-17酶联免疫吸附试验(enzyme-1inked immunosorbent assay，ELISA)定量检测试剂盒(美国R&D公司)；实时定量PCR试剂盒(美国GeneCopeia公司)；Epics XL型流式细胞仪(美国Beckman-Coulter公司)；垂直电泳仪、蛋白电泳转膜装置、GelDoc 2000型凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)。

1.3 标本采集 抽取两组空腹外周静脉血10 mL，采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMCs)，采用免疫磁珠法从单个核细胞中分选CD4+T细胞，所有操作均严格按照使用说明书进行。流式细胞术检测细胞的纯度。

1.4 外周血miRNA-155、表达IL-17A细胞比例及IL-17检测 取两组分选的CD4+T细胞，加入10 U/mL IL-2、10 ng/mL IL-23、20 μg/L IL-6刺激培养72 h，诱导Th17分化。①采用qPCR法检测外周血miRNA-155 取转染48 h后各组细胞，TRIzol试剂提取细胞总RNA，取0.5 μg总RNA，逆转录合成cDNA后扩增。miRNA-155正向引物序列：5′-GCCGTTAATGCTAATCGTGAT-3′，反向引物序列：5′-TGGGTTCATTTTCTGGGTCTT-3′；以U6作为内参，正向引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCAC-3′，反向引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR体系为25 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火、延伸60 s，共40个循环。采用ABI 7500荧光定量PCR仪检测各样本的域值循环数 (CT值)，以2-△△CT代表目的基因的相对表达量。②采用流式细胞仪测算表达IL-17A细胞比例取对数生长期各组细胞，培养24 h，取1×106个细胞悬浮液加入2 mL离心管中，1 500 r/min离心5 min(离心半径13.5 cm)，弃上清；加入1 mL冷PBS洗涤，离心后弃上清；加入用PBS稀释的CD4+FITC抗体100 μL和IL-17A荧光标记的抗体，空白对照管中加入对应的IgG，的PBS，吹打混匀，置于流式管中，采用流式细胞仪测算各组IL-17A细胞所占比例。③采用酶联免疫吸附试验检测外周血Th17，所有操作遵照郑州大学医学伦理委员会人体试验管理规范执行。实验均重复3次，取平均值。

1.5 抑制miRNA-155对寻常型银屑病患者外周血CD4+T细胞分化的影响

1.5.1 细胞分组及miRNA-155转染方法 取“1.3”中分离培养的寻常型银屑病患者外周血CD4+T细胞。加入10 U/mL IL-2、10 ng/mL IL-23、20 μg/L IL-6刺激培养72 h，诱导Th17分化；将诱导分化的细胞2×106/孔接种于6孔板中，细胞铺板在2 mL含血清、不含抗生素的培养基,细胞融合60%～70%时，将细胞分为miRNA-155模拟物组、miRNA-155抑制物组、空白对照组。miRNA-155模拟物组、miRNA-155抑制物组、空白对照组分别加入含Lipofectamine2000的DMEM高糖培养基+50 nmol/LmiRNA-155模拟物、含Lipofectamine2000的DMEM高糖培养基+50 nmol/LmiRNA-155抑制物、含有Lipofectamine2000的DMEM高糖培养基，各组转染体系为500 μL。孵育6 h，改用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、2 mmol/L的谷氨酰胺的RPMI 1640培养基，37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，取少量细胞悬液，涂布于载玻片，倒置相差萤光显微镜下调至蓝色激发萤光，观察各组细胞转染情况，转染成功细胞发出绿光。计算各组转染率。可见光下固定1个视野计数，计数总细胞数，然后转换萤光光源，计数发出绿色萤光的细胞。转染率=发出绿色萤光细胞数/总细胞数×100%。

1.5.2 CD4+T细胞表达IL-17A细胞比例、培养液IL-17检测方法 采用流式细胞仪。取对数生长期各组细胞，采用流式细胞仪测算各组IL-17A细胞所占比例。取对数生长期各组细胞，采用酶联免疫吸附试验检测IL-17A。实验重复3次，取平均值。

1.5.3 细胞miRNA-155、IL-17A和Ets-1mRNA检测 采用qPCR法。取转染48 h后各组细胞，TRIzol试剂提取细胞总RNA，取0.5 μg总RNA，逆转录合成cDNA后扩增。miRNA-155模拟物正向引物序列、反向引物序列同“1.4”，miRNA-155抑制物正向引物序列5′-GGAGGTTAATGCTAATCGTGATAG-3′，反向引物序列： 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；以U6作为内参。IL-17A正向引物序列：5′-CGGCTGGAGAAGATACTGGT-3′，反向引物序列：5′-TTAGTCCGAAATGAGGCTGTC-3′。Ets-1正向引物序列：5′-TCTGGATAG-GCTGGGTTGA-3′，反向引物序列：5′-CGCCCTGGGTAAAGACTGC-3′。IL-17A、Ets-1以β-actin为内参，β-actin正向引物序列：5′-GGCTACAGCTTCACCACCAC-3′，反向引物序列：5′-TGCGCTCAGGAGGAGC-3′。所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR体系为25 μL。反应条件同“1.4”，以2-△△CT代表目的基因的相对表达量。每个样本均测3次，取平均值。

1.6 Ets-1基因siRNA与miRNA-155共同作用对CD4+T细胞分化的影响

1.6.1 细胞分组及Ets-1基因siRNA、miRNA-155转染方法 取“1.3”中分离培养的寻常型银屑病患者外周血CD4+T细胞，加入IL-2刺激培养72 h，将细胞分为A、B、C组。A、B、C组分别加入含Lipofectamine2000的DMEM高糖培养基+50 nmol/LmiRNA-155模拟物、含Lipofectamine2000的DMEM高糖培养基+50 nmol/LmiRNA-155抑制物、含有Lipofectamine2000的DMEM高糖培养基。A、B、C组再各自分为两个亚组，分别转染Ets-1siRNA、Ets-1siRNA阴性对照(分为A1、A2、B1、B2、C1、C2)，培养48 h。

1.6.2 各组细胞IL-17A和Ets-1mRNA检测方法 采用荧光定量RT-PCR法检测IL-17A和Ets-1mRNA。Ets-1基因siRNA序列正向引物：5′-GCAGAAAGAGGAUGUGAAAUU-3′，反向引物：5′-UUUCACAUCCUCUUUCUGCUU-3′，siRNA干扰序列由上海吉玛生物公司合成。IL-17A、Ets-1以β-actin为内参，反应条件同“1.4”，以2-△△CT代表目的基因的相对表达量。每个样本均测3次，取平均值。

1.6.3 各组细胞Ets-1蛋白检测方法 收集各组细胞，蛋白裂解液提取细胞总蛋白，冰浴中充分匀浆，冰上静置30 min。14 000 r/min，4 ℃离心20 min(离心半径10 cm)，取上清蛋白液。Bradford法测定蛋白浓度。取蛋白样品于10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，每泳道上样60 μg变性蛋白，待目的蛋白及内参分离后半干转(0.1 A，35 min)将蛋白转至孔径为0.45 μm的聚偏氟乙烯膜。5%脱脂牛奶(1×TBST稀释)室温摇床封闭1 h，随后加入Ets-1兔抗人一抗(1∶1 000，1 × TBST稀释)，4 ℃摇床过夜。室温摇床复温30 min，辣根过氧化物酶标记的兔二抗IgG(1∶1 000，1×TBST稀释)室温摇床孵育1 h，ECL化学发光显色。内参选用β-actin，采用Gel-Doc2000软件对图片进行灰度分析，将目的条带与内参的灰度比值作为目的蛋白的相对表达量。每个样本重复实验3次，取平均值。

2 结果

2.1 寻常型银屑病、健康体检者外周血miRNA-155、IL-17A细胞比例及IL-17相对表达量比较 寻常型银屑病、健康体检者外周血miRNA-155相对表达量分别为5.69±1.24、1.78±0.42，二者比较，P<0.05。常型银屑病、健康体检者外周血IL-17A细胞15.89%±2.63%、4.72%±2.57%，二者比较，P<0.05。常型银屑病、健康体检者外周血IL-17水平分别为(28.67±3.85)、(7.41±2.34)ng/mL，二者比较，P<0.05。

2.2 各组CD4+T细胞表达IL-17A细胞比例、IL-17水平比较 模拟物组、抑制物组、空白对照组CD4+T细胞表达IL-17A细胞比例分别为34.56%±4.78%、19.21%±1.56%、21.23%±2.65%，组间两两比较，P均<0.05。模拟物组、抑制物组、空白对照组培养液IL-17水平分别为(1 486±137)、(783±86)、(886±100)pg/mL，组间两两比较，P均<0.05。

2.3 各组细胞miRNA-155、IL-17A和Ets-1mRNA相对表达量比较 见表1。

表1 各组细胞miRNA-155、IL-17A和Ets-1mRNA相对表达量比较

注：与空白对照组、抑制物组比较，#P<0.05。

2.4 各组细胞IL-17A、Ets-1mRNA相对表达量比较 见表2。

表2 各组细胞IL-17A、Ets-1mRNA相对表达量比较

注：与本组比较，#P<0.05；与B组比较，＊P<0.05。

2.5 各组细胞Ets-1蛋白相对表达量比较 A组Ets-1siRNA、Ets-1siRNA阴性对照者的Ets-1蛋白相对表达量分别为0.21±0.11、0.31±0.13，B组Ets-1siRNA、Ets-1siRNA阴性对照者的Ets-1蛋白相对表达量分别为0.33±0.12、0.56±0.27，C组Ets-1 siRNA、Ets-1 siRNA阴性对照者的Ets-1蛋白相对表达量分别为0.31±0.10、0.65±0.22，与本组Ets-siRNA阴性对照者比较，Ets-siRNA者Ets-1蛋白相对表达量均降低(P均<0.05)。

3 讨论

Th17细胞通过分泌IL-17等细胞因子发挥促炎作用，连接天然免疫和适应性免疫，还能刺激角质形成细胞分泌 TNF-α和表皮增殖[8]。也有研究[9]发现miRNA-155不仅控制CD4+T细胞分化，还调控正常B细胞的分化，表明miRNA-155可能是免疫系统的重要调控者。miRNA在免疫系统中执行精细的调节作用，例如在巨噬细胞中，靶基因是IL-13Rα[10]；在CD4+T细胞各亚群中，调节性T细胞中的靶基因是SOCS1[11]，而向Th1亚群分化时靶基因为IFN-γRα，而不是SOCS1[12]；miRNA-155还可以通过抑制Shipl基因的表达而调控IFN-γ的水平[13]。

O′Connell等[9]证实miRNA-155(-/-)小鼠能有效抵抗实验性自身免疫性脑脊髓炎的发生，因为miRNA-155能促进Th17和Th1细胞亚群的发育。另有动物试验[14]证实miRNA-155(-/-)小鼠不会发展成胶原诱导性关节炎，miRNA-155缺陷可以阻止自身反应性B细胞和T细胞的产生。miRNA-155(-/-)小鼠不仅局部淋巴结的Th17相关细胞因子IL-17水平显著下降，而且血清中的IL-17和IL-6均比野生小鼠降低，表明miRNA-155缺陷可使Th17细胞分化受阻，提示miRNA-155在Th17细胞发育并分泌相关细胞因子过程中起着关键性的作用。

本研究结果显示miRNA-155模拟物组Th17细胞表达和IL-17A水平明显高于空白对照组和miRNA-155抑制物组，提示miRNA-155能够促进Th17细胞分化；进一步检测miRNA-155、IL-17A和Ets-1的mRNA，结果显示miRNA-155模拟物组miRNA-155、IL-17A mRNA表达显著升高，Ets-1mRNA表达明显降低，提示miRNA-155可能通过抑制Ets-1来促进IL-17的表达。Du等[15]报道miRNA-326通过调控其靶基因Ets-1促进IL-17表达参与多发性硬化症的发病，证实Ets-1是Th17亚群分化产生IL-17的重要负性调控因子。Romania等[4]利用生物信息学分析以及实验均证实Ets-1也是miRNA-155的靶基因。Yao等[16]还证实miRNA-155通过其靶基因SOCS1调控Th17细胞的分化和Th17细胞的功能。表明miRNA-155在免疫系统中的调控作用是错综复杂的，提示在不同的免疫细胞或者向不同亚群分化过程中，miRNA-155是通过不同的特异性靶基因来调控。

综上所述，寻常型银屑病患者外周血CD4+T细胞miRNA-155水平升高、Ets-1水平降低。抑制miRNA-155表达可抑制CD4+T细胞分化为Th17细胞，其机制可能为抑制Ets-1mRNA及蛋白表达。本研究仅限于体外对纯化的CD4+T细胞进行研究，需进一步利用动物模型来阐明miRNA-155在银屑病中的作用机制。