三种基因检测分型方法在耐碳青霉烯抗生素肺炎克雷伯菌基因分型中的应用对比观察

王凤平，朱梓年，张霆，张拔山

(东莞市人民医院，广东东莞523000)

目前，碳青霉烯类药物是治疗肠杆菌科细菌感染最强效的β-內酰胺类药物[1,2]。一旦细菌发生碳青霉烯类药物耐药，严重影响临床治疗效果[3,4]。全国细菌耐药监测网显示，2015年我国耐碳青霉烯类抗生素的肠杆菌科细菌(CRE)发生率约为7.6%，且呈逐年上升趋势。肺炎克雷伯菌是引起医院感染的临床分离率最高的细菌之一。了解耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的同源性，掌握其流行病学特点，可以有效的防止CRE在我国的播散。当前，常用的分子流行病学分析的方法包括限制性内切酶联合脉冲场凝胶电泳(PFGE)、随机多态核苷酸序列(RAPD)、肠杆菌基因间重复序列PCR(ERIC-PCR)、基因外重复回文序列PCR(REP-PCR)、多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)和多位点核酸序列测定(MLST)等。其中PFGE和MLST的分型结果准确，被誉为分子流行学分析细菌的“金标准”[5]，但这两种方法对技术设备要求高、检测周期长、费用高，限制了其在基层医院中的开展和大规模应用。目前关于PFGE、MLVA和ERIC-PCR在耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的应用情况相关报道较少。2013年1月～2015年12月，本研究比较了PFGE、MLVA和ERIC-PCR对耐碳青霉烯抗生素的肺炎克雷伯菌的分型效果，旨在寻求一种或两种可以应用于基层医院的同源性分析的方法。

1 资料与方法

1.1 菌株来源 选择东莞市人民医院2013年～2015年间临床分离的20株耐碳青霉烯类抗生素的肺炎克雷伯菌，菌株均保存于脱脂牛奶，-70 ℃低温。实验前把菌株从脱脂牛奶复苏到血平板，再从血平板中挑取纯菌株的单个菌落于250 μL的无菌蒸馏水中配成细菌悬液，备用。全部20株复苏菌株在培养基传代培养后生长状态良好。

1.2 耐碳青霉烯抗生素的肺炎克雷伯菌的分型方法

1.2.1 PFGE分型方法 参照国际实验室分子分型监测网络PulseNet中肺炎克雷伯菌PFGE分型标准化方案进行实验[5,6]。用bioMérieux DENSIMAT比浊仪调整细菌悬液浓度，使浊度为3.8～4.0。加入1% Seakem Gold:1% SDS胶，混匀制备胶块。使用含蛋白酶K的细胞裂解液(CLB)消化2 h。纯水清洗胶块2次；TE(10 mmol/L Tris:1 mmol/L EDTA，pH值8.0)清洗胶块4次。使用45U XbaⅠ(TAKARA公司)内切酶进行酶切，37 ℃孵育2 h。在CHEF-DR Ⅲ(Bio-Rad Laboratories公司)电泳仪中进行脉冲场电泳。电泳参数为6～36 s，18.5 h。电泳结束后，使用GelRed核酸染料染色。在读胶仪中成像，并转换成TIFF图像格式保存。PFGE图像录入BioNumerics软件包进行处理，识别图像条带，经统一的分子质量标准，进行聚类，构建聚类树。分子量标准用H9812经过XbaI酶切后的片段。

1.2.2 MLVA分型方法 使用Quigen细菌核酸提取试剂盒提取20株细菌的DNA。使用参考文献中的8对引物[7]，引物见表1。分别对20株菌的DNA进行PCR扩增。PCR反应体系：总体积20 μL，其中10×PCR缓冲液2 μL, MgCl21.25 μL,dNTP1.6 μL,引物0.5 μL, DNA模板0.5 μL, TaqDNA聚合酶1 U，灭菌双蒸水14 μL。反应条件为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s, 58 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶中(含0.5 μg/mL溴化乙锭)，电压为5 V/cm,电泳60 min。凝胶成像仪观察结果。将片段大小作为字符，导入BioNumerics软件包进行处理，构建最小生成树。

表1 MLVA分型所用的引物序列

1.2.3 ERIC-PCR分型方法 使用Quigen细菌核酸提取试剂盒提取DNA。引物：ERIC-2序列：aagtaagtgactggggtgagcg[8]。PCR反应体系：总体积20 μL，其中10×PCR缓冲液2 μL, MgCl2 1.25 μL,dNTP1.6 μL,引物0.5 μL, DNA模板0.5 μL, TaqDNA聚合酶1 U，灭菌双蒸水14 μL。反应条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s, 52 ℃退火45 s, 72 ℃延伸4 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶中(含0.5 μg/mL溴化乙锭)，电压为5 V/cm，电泳90 min，凝胶成像仪观察结果。图谱录入BioNumerics软件包进行处理，识别图像条带，进行聚类，构建聚类树。

1.3 Simpson差异指数测算 采用BioNumerics软件进行同源性分析，测算各方法Simpson差异指数(D值)，计算公式为D=1-{∑[nj (nj-1)]}/ [N (N-1)]，其中nj为属于第j个型别的菌株数，N为特定群体中的总菌株数。D值介于0～1之间，D值越趋于1表示该方法分辨力越好。

2 结果

2.1 PFGE分型结果 20株耐碳青霉烯抗生素的肺炎克雷伯菌最终分为18个PFGE型，其中2个带型包含2株菌，其余16个带型分别只包含1株菌。其中1号和12号、2号和7号两组菌分别具有相同的PFGE型别，提示1号和12号、2号和7号之间可能存在流行病学关联。

2.2 MLVA分型结果 20株菌的MLVA分型结果显示20株耐碳青霉烯抗生素的肺炎克雷伯菌最终分为17个MLVA型，其中3个型别分别包含2株菌，其余16个型别只包含1株菌。以差异位点为小于等于2个位点作为构建MLVA群的标准，20株菌中构建出4个MLVA克隆群。

2.3 ERIC的分型结果 20株菌分为14个ERIC型，其中优势型别包含5株菌(6、11、12、13、18)，次优势型别包含3株菌(7、8、14)，其余12个型别分别只包含1株菌。

2.4 PFGE、MLVA、ERIC-PCR三种分型方法的比较 PFGE、MLVA和ERIC-PCR法对耐碳青霉烯抗生素的肺炎克雷伯菌的D值分别为0.989 5、0.984 2、0.931 6。

3 讨论

PFGE是一种分型能力较高的分子流行病学调查工具[5,6]。它用限制性位点相对少的酶消化细菌的基因组，得到数量相当少但更大的限制性片段，采用了两个交变电场电泳，穿过琼脂糖的电场作周期性的改变，使得DNA分子的电泳方向随着电场的变化而变化，大分子DNA得以分离，最后可以产生一个有5～20条清晰的分辨较好的图谱。PFGE方法的分辨力和可重复性都很高，是肠球菌、肠杆菌和葡萄球菌基因分型的“金标准”。从本研究的研究结果看到，20株肺炎克雷伯菌被分为18个PFGE型，D值为0.989 5，说明PFGE具有较好的分型能力。但PFGE操作中必须使所有酶与缓冲液浸透凝胶块，完成鉴定时间较长，且不适合没有标准化的实验室。同时PFGE专业设备昂贵，试剂价格高，严重影响了PFGE在基层医院的应用。

MLVA是依据基因组中可变数目串联重复序列(VNTR)的特征来达到菌株基因分型的目的。VNTR是指由一段核苷酸序列(核心序列)多次串联重复所形成的高度可变区域[9,10]，其结构主要由两部分组成，中间的核心区和外围的侧翼区，中间的核心区为串联重复单位，每个重复单位在两个到几十个碱基之间，重复2～20次。MLVA分型技术采用了多重PCR扩增技术，能对多个VNTR位点同时进行分析，结果以数字方式输出，通过相关电脑软件进行聚类分析，分析所用的仪器也较简单，易获得，几乎整个过程都可以由计算机自动化处理。且与PFGE相比，MLVA分型结果采用较简便数字形式，有助于细菌的分子流行病学研究。在本研究中20株肺炎克雷伯菌被分为17个MLVA型，D值0.984 2。与“金标准”PFGE相比，D值只差了0.005 3，说明MLVA分型能力与PFGE十分相近。本实验的MLVA以差异位点为小于等于2个位点作为构建MLVA群的标准，20株菌中构建出4个MLVA克隆群。可以通过菌株的流行病学信息和其他生物学信息进一步寻找各克隆群的特征。相对PFGE来说，MLVA相对客观，易于操作，并且可在短时间内就可以获得较好的结果。另外，MLVA一次可以处理大量的样品，可以将PFGE有时不能区分的具有不可分辨电泳模式的菌株精确区分。同时，MLVA分型只需要普通的PCR仪和电泳仪等简单的设备，价格也相对便宜，这十分适用于普通的医院。

ERIC-PCR分型技术是以肠杆菌科基因间重复序为引物进行PCR，能扩增出多态性的DNA图谱，根据扩增出来的条带大小和数目进行分型。ERIC-PCR条件相对简单，只需要简单的PCR仪和电泳仪，而且重复性较好，此方法已由国内外许多学者将其与PFGE、RAPD和限制性内切酶等DNA分型技术进行比较，其分辨率与PFGE 高度一致[11]。在本研究中20株肺炎克雷伯菌被分为14个基因型，D值为0.931 6。并且可以通过菌株的流行病学信息和其他生物学信息进一步寻找各型别(尤其是优势型别和次优势型别)的特征。虽然其分型能力相对于PFGE和MLVA来说稍微逊色一点，但它只需要一条肠杆菌科细菌通用的引物，不需要针对每种不同细菌再进行引物的合成，是三者中条件设备最为简单的方法。这在基层医院尤为适用。

另外，从本研究的PFGE分型结果可以看到，20株耐碳青霉烯类抗生素的肺炎克雷伯菌一共被分为18个PFGE型，其中16个带型分别只包含1株菌。这说明这些耐碳青霉烯类抗生素的肺炎克雷伯菌大部分都是散发存在的。但是，这其中的1号和12号、2号和7号两组菌分别具有相同的PFGE型别，提示1号和12号、2号和7号之间可能存在流行病学关联。这四株细菌必须引起重视，它们之间可能存在克隆的关系。

综上所述， PFGE、MLVA和ERIC-PCR对耐碳青霉烯抗生素的肺炎克雷伯菌的分型结果均较好。MLVA、ERIC-PCR的分型结果与PFGE相近，且需要的条件设备简单、价廉，可应用于基层医院进行细菌的同源性分析，有利于预防和控制耐药菌株的扩散。