过敏性紫癜患儿外周血单核细胞Toll样受体2的表达变化及意义

朱海涛，吕进泉，王秋霞，相虹

(江苏大学附属医院，江苏镇江212000)

过敏性紫癜(HSP)是一种儿童常见的血管变态性出血性疾病，临床表现主要为非血小板减少性紫癜、关节肿痛、腹痛及肾脏损伤(以蛋白尿或血尿为主)[1]。紫癜性肾炎(HSPN)是HSP的常见并发症，严重影响HSP的病程及预后[2]。目前HSP的病因及发病机制尚未完全阐明，免疫功能紊乱、体液免疫异常导致大量免疫球蛋白(Ig)A的沉积是HSP重要致病因素这一论点普遍为学者所接受[3]。HSP 患者的细胞免疫功能紊乱主要表现在急性期外周血中T淋巴细胞亚群异常，CD4+T/CD8+T 比值下降(即CD4+T细胞数量降低，CD8+T细胞数量增高)，其中Th1/Th2 免疫应答失衡，即Th1功能降低，Th2优势活化[4]。Toll 样受体(TLRs)可通过识别病原微生物表面上各种不同的病原模式相关分子，激活细胞内信号转导通路级联反应，最终产生一系列炎症细胞因子[5]。TLRs的激活诱导了Th1型适应性免疫应答, 在这一过程中产生干扰素 (IFN-γ)的CD4+T细胞占优势。TLR的激活诱导如白细胞介素12(IL-12)、IL-23和IL-27等细胞因子的表达, 促使未成熟前体细胞Th0向Th1细胞分化, 并且抑制Th2细胞分化, 在向Th2细胞分化过程中分泌IL-4、IL-5和IL-13, 但不分泌IFN-γ[6，7]。TLR2受体在Toll样受体家族中表达范围最广，是识别病原微生物种类最多的成员，它可触发机体对致病微生物的级联免疫应答，已经成为多种疾病治疗的新靶点[8]。本研究观察了HSP患儿外周血TLR2的表达变化，并分析其在Th1/Th2免疫应答过程中的作用。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2014年3月～2017年11月间于我院住院治疗的71例HSP患儿，其中男40例、女31例。纳入标准：①符合2006年欧洲抗风湿病联盟(EULAR)和欧洲儿科风湿病学会(PReS)制定HSP诊断标准[9]。②首次发病且患儿年龄≤14岁。③近1个月内未接受过任何肝素、糖皮质激素类和免疫抑制剂类药物的治疗。排除标准：①既往或目前患有原发性肾脏疾病，如肾病综合征、Ig A 肾病、肾小球肾炎等。②存在如系统性红斑狼疮等免疫性疾病引起的肾脏损害。③有血小板减少性紫癜，血友病、白血病等血液系统疾病。根据2009年中华医学会儿科学分会肾脏病学组的紫癜性肾炎的诊治循证指南(试行)中的诊断标准[10]，将71例患儿分为无肾损害者(NHSPN)及有肾损害者(HSPN)。NHSPN35例中男19例，女16例；年龄4～13(6.56 2.26)岁。HSPN36例中男21例，女15例；年龄3～13(5.98 2.98)岁。另选同期在我院志愿参加研究的35例健康儿童作为对照组，男20例，女15例；年龄3～13(5.66 2.53)岁。三组患儿在性别、年龄上差异具有可比性。本研究获得医院医学伦理委员会讨论通过，所有纳入者均征得家属知情同意。

1.2 外周血单核细胞(PBMCs)中TLR2 mRNA检测方法 收集纳入者静脉血3 mL，无菌肝素抗凝，无菌状态下密度梯度离心，得到PBMC。采用RT-PCR法检测PBMC中TLR2 mRNA：TRIzol提取RNA，测定RNA浓度及纯度，逆转录合成cDNA，进行荧光定量PCR反应检测目的基因TLR2的mRNA(以GADPH作为内参蛋白),以2-△△Ct代表TLR2 mRNA的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.3 外周血CD14+单核细胞表面TLR2蛋白检测方法 收集纳入者静脉血3 mL，采用流式细胞术检测外周血CD14+单核细胞表面TLR2蛋白：分别取100 L外周静脉血，加入5 L CD14-FITC抗体，测试管加入5 L TLR2-PE抗体，对照管中加入5 L PE标记的Mouse IgG2 抗体，37 ℃避光孵育15 min，加入3 mL溶血素混匀，静置15 min后1 500 rpm离心5 min，PBS洗涤2次，300 L PBS重悬，Cytomics FC500 型流式细胞仪上检测TLR2阳性细胞所占比例。

1.4 外周血IFN-γ、IL-4检测方法 抽取纳入者空腹静脉血3 mL，采用酶联免疫吸附法测量血清IFN-γ、IL-4。按照IL-4试剂盒(上海联迈生物工程有限公司)和IFN-γ试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)说明书的步骤进行实验，分别在450 nm处读取待测物的光密度(OD)值，绘制标准曲线后得到每个待测样品血清中IFN-γ、IL-4含量。

2 结果

HSPN、NHSPN及对照组PBMCs 中TLR2 mRNA的相对表达量分别为1.97±0.76、1.50±0.70、1.11±0.52，两两比较,P均<0.05。HSPN、NHSPN及对照组外周血CD14+单核细胞表面TLR2蛋白含量分别为0.44±0.29、0.19±0.12、0.09±0.06，两两比较,P均<0.05。三组血清IFN-γ、IL-4水平及IFN-γ/IL-4比较见表1。

表1 三组受血清IFN-γ、IL-4水平及IFN-γ/IL-4比较

注：与对照组相比，*P<0.05；与NHSPN相比，#P<0.05。 HSP患儿CD14+单核细胞表面TLR2蛋白蛋白表达与血清IFN-γ水平呈负相关(r=-0.906,P=0.000)；与IL-4水平呈正相关(r=0.994，P=0.000)。

3 讨论

HSP是一种以全身小血管炎症为主要病变的临床综合征，20%以上的HSP患儿都伴随着肾损伤的发生[11]。目前HSP的发病机制尚未完全明确，目前公认的主要发病机制包括T淋巴细胞功能失调、体液免疫异常和细胞因子分泌异常的免疫功能紊乱。除此之外，炎症介质、凝血与纤溶机制等多方面因素可能共同参与了HSP的发病发展过程。HSP病情的发展与T淋巴细胞的免疫功能紊乱紧密相关。成熟的T淋巴细胞包括CD4+、CD8+两个细胞亚群。研究[12]发现，HSP患儿体内外周血中细胞因子微环境发生变化后导致CD4+T细胞数量降低，而CD8+T细胞数量增高，CD4+/CD8+比值明显降低，表明CD4+/ CD8+T细胞比例失衡可能是参与HSP发病的因素之一。将CD4+T淋巴细胞按照分泌的细胞因子及其功能的不同，分为Th1、Th2、Th17和调节性T细胞(Treg)四个亚群。正常情况下Th1和Th2之间动态的调节使得机体免疫处于动态平衡。如果这种平衡遭受破坏，就可能会导致免疫功能调节紊乱，进而引起疾病。Th1细胞可分泌IFN-γ、IFN-γ及IL-12等细胞因子。巨噬细胞经IFN-γ刺激后会释放大量IL-12，刺激其他Th0细胞向Th1型分化，并抑制其向Th2型分化，构成正反馈通路。Th2细胞分泌IL-4、IL-5和IL-13等与抗体产生和抑制的细胞因子。IL-4一方面通过诱导B细胞表面抗原CD23的表达来促进B细胞的活化并促进IgE等合成过程、下调IFN-γ的分泌，使得机体处于慢性持续性炎症的状态。另一方面IL-4可通过抑制Th1细胞的活化，从而促使Th0细胞分化成Th2型，进而Th2继续大量分泌IL-4，形成正反馈调剂机制，促进免疫反应的发生[13]。故IL-4是将体液免疫和细胞免疫联系起来的细胞因子。而B淋巴细胞的活化，可促进B细胞分泌的免疫球蛋白向IgA转化，从而患儿体内IgA水平增高。进一步地，IgA和IgA免疫复合物逐渐沉积在小血管中，从而损伤血管内皮引起炎症反应，从而加重HSP的疾病进展[14，15]。本研究结果发现，HSP患儿PBMCs中IFN-γ水平和IFN-γ/IL-4比值低于对照组，IL-4水平高于对照组，且HSPN组中IFN-γ水平和IFN-γ/IL-4比值显著低于NHSPN组，IL-4水平显著高于NHSPN组，说明HSP患儿存在Thl /Th2免疫失衡和Th2过度活化的现象，Th2活化可能与肾损伤紧密相关。

TLRs是一种Ⅰ型跨膜蛋白，可识别内源性或外源性配体，通过信号传导途径分别激活转录因子诱导炎症细胞因子、趋化因子基因转录。当传导途径异常活化时，可干扰机体自身免疫机制，导致免疫功能紊乱[16]。TLRs在调节Th1/Th2免疫平衡中的作用：一方面，TLRs通过信号转导途径与MyD88蛋白共同参与Thl/Th2的调节反应。有研究[17]表明，用脂多糖(LPS)刺激去除小鼠树突状细胞的MyD88蛋白后可诱导T细胞分泌IL-4而不能分泌IL-12和IFN-γ，即表现为Th1反应缺陷；另一方面，TLRs通过配体参与Th1/Th2的调节反应，有研究发现TLR2与配体结合后可诱导Th2型细胞因子分泌IL-4，导致Th2型免疫应答反应[18]。Zhao等[19]发现，TLR2、TLR4可在炎症模型中诱导Th2型免疫应答反应。

本研究结果，与对照组比较，HSP患儿PBMCs中的TLR2 mRNA及蛋白表达水平均升高，HSPN TLR2的基因及蛋白表达显著高于NHSPN。结果提示HSP患儿中TLR2表达水平显著增加，且有肾损伤的HSP会伴随着TLR2的过度激活。同时本研究还发现HSP患儿PBMC中的TLR2蛋白表达与血清IFN-γ水平呈负相关，与IL-4水平呈正相关。说明HSP患儿中TLR2可能参与到Thl/Th2的调节反应中，参与IFN-γ和IL-4的分泌调节并使Th2型免疫应答反应上调。

综上所述， HSP患儿外周血PBMCs 中TLR2表达升高，且HSPN患儿外周血PBMCs 中TLR2表达升高更明显。TLR2可能通过降低IFN-γ水平、升高IL-4水平参与HSP的肾损伤。