MicroR N A-20b在卵巢癌细胞中的表达及对增殖和凋亡的影响*

姜慧君，贺漪

（湖北省武汉市第一医院 妇产科,湖北 武汉 430022）

MicroR N A-20b在卵巢癌细胞中的表达及对增殖和凋亡的影响*

姜慧君，贺漪

（湖北省武汉市第一医院 妇产科,湖北 武汉 430022）

目的探讨microRNA-20b（miR-20b）在卵巢癌细胞系中的表达及对增殖和凋亡的影响。方法实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）测定miR-20b在卵巢癌细胞系A431、SKOV3及正常卵巢上皮细胞系Hose中的相对表达量，将SKOV3细胞系分成未转染对照、阴性对照及miR-20b模拟物组，用Lipofectamine 2000分别不转染、转染miR-20b scramble和miR-20b mimics，CCK8实验测定3组细胞增殖能力，流式细胞术测定3组细胞凋亡，Western blot测定张力蛋白同源在10号染色体有缺失的磷酸酶（PTEN）、裂解型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）的相对表达量。结果qRT-PCR示A431、SKOV3细胞系miR-20b相对表达量较Hose细胞系低；miR-20b模拟物组在0、24、48、72及96 h的OD45 nm值低于未转染对照组和阴性对照组；miR-20b模拟物组凋亡率高于阴性对照组和未转染对照组；miR-20b模拟物组PTEN相对表达量低于阴性对照组，裂解型PARP蛋白相对表达量高于阴性对照组。结论miR-20b抑制卵巢癌细胞增殖并促进凋亡，其机制可能与下调PTEN和上调PARP蛋白表达有关。

miR-20b;卵巢癌；增殖；凋亡

卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤，在发达国家，年龄标化发病率为十万分之9.1，年龄标化死亡率为十万分之5.0；在发展中国家，年龄标化发病率为十万分之5.0，年龄标化死亡率为十万分之3.1[1]。在卵巢癌早期，经手术、化疗等综合治疗后，5年生存率可达90%，而对于晚期卵巢癌，5年生存率则降至50%[2]。目前，对于卵巢癌的发病机制尚不十分清楚，深入研究卵巢癌的发病机制对设计合理的药物具有重要的意义。microRNA是一类长度约19～22 nt的微小RNA，其通过与靶基因结合介导转录后的负调控[3]，在肿瘤增殖、凋亡、侵袭、转移等过程中起着重要的作用[4]。microRNA-20b（miR-20b）属于microRNA-17大家族中miRNA 106a-363 cluster亚家族成员[5]，miR-20b被报道参与调节骨肉瘤[6]、膀胱癌[7]、乳腺癌[8]、食管癌[9]、胃癌[10]的增殖、自噬、迁移和侵袭等肿瘤生物学过程。然而，miR-20b对卵巢癌的增殖和凋亡的影响，目前尚未见报道，本研究在体外研究miR-20对卵巢癌增殖和凋亡的影响，并揭示其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料及设备

卵巢癌细胞系A431、SKOV3及正常卵巢上皮细胞系Hose（美国ATCC公司），DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶（美国Hyclone公司），Trizol（美国Invitrogen公司），Western blot所用一抗（美国BD公司），HRP标记的二抗（美国 Invitrogen公司），miR-20b mimics及scramble均由广州锐博公司合成。Lipofectamine 2000 reagent（美国Invitrogen公司），ABI Prism 7700系统的SYBR Green Reagents（日本TaKaRa公司）。

1.2 细胞培养及转染

将卵巢癌细胞系A431、SKOV3及正常卵巢上皮细胞系Hose加入DMEM培养基，培养于37℃、5%二氧化碳CO2培养箱中，培养48 h后消化传代。将卵巢癌SKOV3细胞系分成未转染对照组、阴性对照及miR-20b模拟物组，阴性对照组及miR-20b模拟物组采用Lipofectamine 2000 reagent分别转染miR-20b scramble和miR-20b mimics，未转染对照组用PBS处理，作为空白对照，miR-20b模拟物组转染序列：miR-20b mimics正向引物：5'-CAAAGUG CUCAUAGUGCAGGUAG-3'，miR-20b mimics 反向引物：5'-ACCUGCACUAUGAGCACUUUGUU-3’；阴性对照组转染序列：miR-20b NC正向引物：5'-UUC UCCGAACGUGUCACGUTT-3'，miR-20b NC 反向引物：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。

1.3 R N A提取及实时定量聚合酶链反应

用All-in-One microRNA抽提试剂盒和All-in-One miRNA实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测试剂盒提取和分离miRNAs，ABI Prism 7700系统的 SYBR Green Reagents qRT-PCR，在ABI 7500实时定量PCR仪中，以U6小核RNA作为内参，使用2-ΔΔCt方法定量，量化miR-20b相对表达水平。

1.4 细胞增殖实验

采用CCK-8法，将3组细胞消化成单细胞悬液，在96孔板上以2×103个/孔接种，每孔培养基体积 200μl。在分别培养 0、24、48、72、96 h 后，每孔加入20μl CCK-8溶液，继续培养1 h后，用酶标仪在450 nm波长下测定各孔吸光值，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制卵巢癌细胞增殖曲线。

1.5 细胞凋亡实验

采用流式细胞术，用Annexin V/PI染色检测，将3组细胞消化成单细胞悬液后，PBS清洗2次，并使用Binding Buffer重悬，加入相应比例的Annexin V抗体，避光染色10 min后加入适量PBS溶液以及PI染料，流式细胞仪检测Annexin V阳性细胞比例来确定细胞凋亡的变化。

1.6 Western blot

将阴性对照组和miR-20b模拟物组两组细胞用RIPA细胞裂解液冰上裂解30 min后，变性、上样，以每孔30μg总蛋白上样，浓缩胶80 V电泳40 min，分离胶100 V电泳2 h。常规湿法转膜，加入10号染色体有缺失的磷酸酶（phosphatase and tensin ho-molog deleted from chromosome 10，PTEN）、裂解型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[Poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]一抗，浓度为 1∶200，37℃孵育 4 h，二抗（1∶500）孵育过夜，ECL液显影，Quantity One 1-D分析软件对蛋白质印迹条带进行定量。目的蛋白相对表达量=目的蛋白测定值/GAPDH，实验重复3次，取平均值。

1.7 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件分析数据，计量资料用均数±标准差（±s）表示，3组间比较先行方差分析，在方差分析有意义的基础上，再行LSD-t或SNK-q检验进行两两比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 m iR-20b在卵巢癌细胞系中低表达

qRT-PCR检测miR-20b在A431细胞系中相对表达量为（0.300±0.050），在SKOV3细胞系中相对表达量为（0.100±0.020），在正常卵巢上皮细胞系Hose中相对表达量为1.000，提示3组间miR-20b的表达量经方差分析，差异有统计学意义（F=155.814，P=0.000）；A431 细胞系中 miR-20b 相对表达量与Hose细胞系比较，行LSD-t检验，差异有统计学意义 （t=-0.700，P=0.000），A431 细胞系中miR-20b相对表达量低于正常卵巢上皮细胞系Hose；SKOV3细胞系中 miR-20b相对表达量与Hose细胞系比较，行LSD-t检验，差异有统计学意义（t=-0.900，P=0.000），SKOV3细胞系中 miR-20b相对表达量低于正常卵巢上皮细胞系Hose。见图1。

2.2 m iR-20b过表达抑制SKO V3细胞增殖

转染miR-20b模拟物24 h后，qRT-PCR示，miR-20b模拟物组的miR-20b表达量是（45±2.800），阴性对照组为1.000，未转染对照组为1.000，3组比较差异有统计学意义（F=5.389，P=0.000）；miR-20b模拟物组与阴性对照组比较，差异有统计学意义（t=-0.872，P=0.000），miR-20b 模拟物组miR-20b相对表达量高于阴性对照组，提示转染成功。见图2A。

转染后0 h，miR-20b模拟物组OD 450 nm值为（0.330±0.030），阴性对照组为（0.350±0.040），未转染对照组为（0.390±0.030），3组OD 450 nm值差异无统计学意义（F=2.471，P=0.164）。

图1 m iR-20b在卵巢癌及正常卵巢上皮细胞系中的表达

转染后24 h，miR-20b模拟物组OD 450 nm值为（0.430±0.080），阴性对照组为（0.750±0.100），未转染对照组为（0.700±0.100），3组OD 450 nm值有统计学差异（F=10.102，P=0.012）；MiR-20b 模拟物组与阴性对照组比较，差异有统计学意义（t=-0.320，P=0.000），与未转染对照组比较，差异有统计学意义（t=-0.270，P=0.000）。

转染后48 h，miR-20b模拟物组OD 450 nm值为（0.720±0.090），阴性对照组为（1.670±0.250），未转染对照组为（1.570±0.200），3组OD 450 nm值比较差异有统计学意义（F=22.175，P=0.001）；MiR-20b模拟物组与阴性对照组比较，差异有统计学意义（t=-0.950，P=0.000），与未转染对照组比较，差异有统计学意义（t=-0.850，P=0.000）。

转染后72 h，miR-20b模拟物组OD 450 nm值为（1.230±0.150），阴性对照组为（2.430±0.190），未转染对照组为（2.5±0.1），3组OD 450 nm值比较差异有统计学意义（F=66.862，P=0.000）；MiR-20b模拟物组与阴性对照组比较，差异有统计学意义（t=-1.200，P=0.000），与未转染对照组比较，差异有统计学意义（t=-1.270，P=0.000）。

图2 m iR-20b过表达抑制SKO V3细胞增殖

转染后96 h，miR-20b模拟物组OD 450 nm值为（1.720±0.200），阴性对照组为（3.780±0.320），未转染对照组为（4.080±0.270），3组OD 450 nm值比较差异有统计学意义（F=68.996，P=0.000），miR-20b模拟物组与阴性对照组比较，差异有统计学意义（t=-2.060，P=0.000）；与未转染对照组比较，差异有统计学意义（t=-2.360，P=0.000）。miR-20b模拟物组在转染后24、48、72和96 h OD450 nm值低于阴性对照组和未转染对照组。见图2B。

2.3 m iR-20b过表达促进细胞凋亡

流式细胞术测细胞凋亡率，示miR-20b模拟物组的凋亡率为（20.150±1.200）%，阴性对照组为（4.000±0.700）%，未转染对照组为（2.800±0.500）%，3组凋亡率比较差异有统计学意义（F=387.581，P=0.000），miR-20b模拟物组与阴性对照组比较，差异有统计学意义（t=16.150，P=0.000），与未转染对照组比较，差异有统计学意义（t=17.350，P=0.000），miR-20b模拟物组凋亡率高于阴性对照组和未转染对照组。见图3。

2.4 m iR-20b抑制增殖并促进凋亡的机制

Western blot检测了PTEN蛋白和与凋亡发生相关的蛋白 Cleaved PARP，miR-20b模拟物组PTEN蛋白相对表达量为（0.370±0.030），阴性对照组为1.000，差异有统计学意义（t=-36.370，P=0.000），miR-20b模拟物组PTEN蛋白相对表达量低于阴性对照组；miR-20b模拟物组Cleaved PARP蛋白相对表达量为（3.500±0.120），阴性对照组为1.000，差异有统计学意义（t=36.080，P=0.000），miR-20b模拟物组Cleaved PARP蛋白相对表达量高于阴性对照组。见图4。

图3 m iR-20b过表达促进SKO V3细胞凋亡

图4 m iR-20b下调PTEN、上调PAR P的表达

3 讨论

卵巢癌是起源于卵巢上皮的恶性肿瘤，依据病理类型可分为卵巢肉瘤和浆液性卵巢癌，96%～99%为浆液性卵巢癌，先手术再化疗比单独手术或者单独化疗效果更佳，但卵巢癌预后仍较差，据报道Ⅳ期卵巢癌5年生存率仅20.3%[11]。在肿瘤演进的过程中，会涉及到一系列重要的分子或信号通路变异，包括 EMT[12]、miRNA[13]、LncRNA[14]、P21[15]、P53[16]等分子。

miRNA是含有茎环结构的miRNA前体，经过Dicer加工之后一类非编码的小RNA分子（18～25个核苷酸），通过与靶基因的种子区序列相互配对抑制其基因的转录或翻译行使其功能，广泛存于真核生物体中[17]。在肿瘤发生发展的过程中，多种miRNA发生表达异常，并广泛参与了增殖、凋亡、自噬、侵袭、转移等过程。比如：miR-124被报道在结肠癌细胞系中下调表达，通过下调ROCK1蛋白表达，miR-124抑制结肠癌细胞增殖、侵袭和转移[18]。Wnt/b-catenin信号通路激活miR-30a-5p并通过抑制NCAM表达促进胶质瘤细胞侵袭[19]。miR-20b在肿瘤中所起的作用不尽相同，在骨肉瘤组织和细胞系中，miR-20b较正常骨组织和细胞系下调表达，miR-20b可靶向调节HIF-1a的表达，上调miR-20b可抑制HIF-1a的表达，下调VEGF信号通路蛋白，抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭，是个抑癌基因[6]。在膀胱癌中，miR-20b在膀胱癌细胞系中低表达，过表达miR-20b抑制膀胱癌细胞系EJ的增殖，通过下调cyclin D1，CDK2和CDK6的表达，诱导G1细胞周期阻滞，并抑制膀胱癌细胞迁移和侵袭，起抑癌基因的作用[7]。在甲状腺乳头状癌中，miR-20b低表达，且与淋巴结转移和TNM分期相关，上调miR-20b表达通过抑制MAPK/ERK信号通路抑制甲状腺K1和TPC-1细胞系活动性和迁移侵袭能力，起抑癌基因的作用[20]。与之相反，在乳腺癌中，miR-20b在乳腺癌组织和细胞中上调表达，且miR-20b可与PTEN 3"UTR靶向结合，上调miR-20b可促进乳腺癌细胞增殖和克隆形成，起促癌基因的作用[8]。miR-20b在乳腺癌脑转移的病人中的表达水平较无脑转移的病人要高[21]，在胃癌中，miR-20b在胃癌组织中高表达，且与淋巴结转移等恶性生物学特征相关，起促癌基因的作用[10]。在食管癌中，miR-20b高表达于食管癌组织和细胞，且通过靶向结合PTEN 3'-UTR而促进食管癌增殖、迁移和侵袭，为促癌基因[9]。在肝癌中，miR20b上调表达，且与肝癌预后差相关[22]。

在本研究中，miR-20b在卵巢癌细胞系A431、SKOV3的相对表达量较正常卵巢上皮细胞系降低，通过对SKOV3细胞系外源性转染miR-20b mimics后，发现miR-20b模拟物组的miR-20b相对表达量较未转染对照组和阴性对照组升高，表示转染成功；进一步采用CCK-8法测定3组细胞增殖能力，发现miR-20b模拟物组OD450 nm值低于对照组和未转染对照组，提示miR-20b可抑制SKOV3细胞增殖。对miR-20b模拟物组、未转染组和阴性对照组行流式细胞术测定凋亡，发现miR-20b组凋亡率高于未转染组和阴性对照组，表明miR-20b可诱导SKOV3细胞凋亡，表明在卵巢癌中，miR-20b起抑癌基因的作用，这与骨肉瘤、膀胱癌、甲状腺癌中的结果一致，而与乳腺癌、胃癌、食管癌、肝癌中所起的作用相反。

PTEN分子是被广泛研究的抑癌分子，其在多种肿瘤中缺乏表达[23]，其通过对磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸肌醇（PIP3）脱磷酸化负调控PI3K/Akt信号通路，最终参与调控细胞周期、增殖、凋亡、迁移和侵袭等肿瘤生物学过程[24]。LI等[25]报道miR-20b可靶向调节PTEN表达，且miR-20b上调可抑制PTEN蛋白的表达，进而促进肝癌肿瘤发生。ZHU等[26]在结肠癌中也发现miR-20b可靶向下调PTEN的表达，在乳腺癌中，ZHOU等[8]通过荧光素酶实验发现miR-20b与PTEN靶向结合，并通过下调PTEN表达促进乳腺癌细胞系ZR-75-30和MCF-7增殖和克隆形成。在本研究中，miR-20b模拟物组PTEN相对表达量较阴性对照组低，miR-20b抑制增殖的机制可能与miR-20b下调PTEN表达有关。

细胞凋亡的通路主要包括内源性途径和外源性途径，外源性途径由肿瘤坏死因子受体1、Fas/CD95、DR3和TRAIL-R1等死亡受体介导，进而激活caspase-3、8诱导凋亡[20]；内源性途径，即线粒体途径，主要通过激活 caspase-3、8、9，PARP，并将DNA裂解为180～200 bp大小的片段，进而诱导细胞发生凋亡[27]，PARP剪切被认为是细胞凋亡的一个重要指标，被认为是Caspase 3激活的指标。本研究发现miR-20b模拟物组裂解型PARP表达量高于阴性对照组，提示miR-20b诱导细胞凋亡的机制可能与PARP升高有关，为内源性通路所介导。

综上所述，本研究发现miR-20b在卵巢癌细胞系中低表达，且上调miR-20b的表达可抑制卵巢癌细胞增殖，并诱导凋亡，其机制可能与PTEN下调、PARP上调有关，这更深入的阐明了卵巢的发病机制，可能成为卵巢癌治疗的新治疗靶点，值得进一步研究。

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（张蕾 编辑）

Expression of miR-20b in ovarian carcinoma cell line and its effect on proliferation and apoptosis*

Hui-jun Jiang,Yi He
(Department of Gynecology and Obstetrics,Wuhan No.1 Hospital,Wuhai,Hubei 430022,China)

ObjectiveTo investigate the expression of miR-20b in ovarian carcinoma cell line and its effect on proliferation and apoptosis.MethodsThe relative expression levels of miR-20b in A431,SKOV3 and Hose cell lines were measured by qRT-PCR.The SKOV3 cell line was divided into non-transfection control group without transfection,negative control group transfected with miR-20b scramble and miR-20b mimics group transfected with miR-20b mimics by Lipofectamine 2000.The proliferation ability was tested by CCK8 assay.The apoptosis rate was measured by flow cytometry.The expression levels of phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome 10(PTEN)and cleaved poly(ADP-ribose)polymerase(PARP)were measured by Western blot.ResultsThe expression levels of miR-20b in the A431 and SKOV3 cell lines were significantly lower than that in the Hose cell line.The value of OD 450 nm in the miR-20b mimics group was significantly lower than that in the non-transfection control and negative control groups at 0,24,48,72 and 96 h.The apoptosis rate of the miR-20b mimics group was significantly higher than that of the negative control and non-transfection control groups.Compared to the negative control group,the expression level of PTEN was down-regulated and the cleaved PARP was up-regulated in the miR-20b mimics group.ConclusionsmiR-20b inhibits proliferation and promotes apoptosis of ovarian carcinoma cells,the mechanism may be associated with down-regulation of PTEN and up-regulaton of cleaved PARP.

miR-20b;ovarian carcinoma cell;proliferation;apoptosis

R737.31

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.13.007

1005-8982（2017）13-0033-06

2016-12-10

武汉市卫计委课题（No：WX15C32）

贺漪，E-mail：heyi879@126.com