人源SIRT4蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化

朱 红,王 春,王 芳,邹叶芳,陈晓雪,刘 亭,李 燕，何 彬

1)贵州医科大学药学院 贵阳 550004 2)贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室 贵阳 550004 3)贵州医科大学民族药与中药开发应用教育部工程研究中心 贵阳 550004 4)贵州医科大学基础医学院化学教研室 贵阳 550004 5)贵州医科大学药用植物功效与利用国家重点实验室 贵阳 550004

存在于哺乳动物的Sir2 又叫沉默信息调节子(Sirtuin，简称SIRT)，人源的SIRT有7个亚型，即SIRT1～7，SIRT4定位于线粒体，涉及线粒体中糖脂代谢过程中许多通路的中间桥梁，广泛作用于整个细胞的各个过程的调节，如能量代谢、细胞凋亡等[1-7]。有研究[8]发现，谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase, GDH)被SIRT4抑制活性，且SIRT4的缺失或过度表达会影响胰岛素的分泌。研究[9-10]表明SIRT4在养分充足的条件下，可以促进脂肪代谢及抑制脂肪酸氧化。还有文献[11]报道，SIRT4的缺失会增加谷氨酰胺依赖的增殖和应激诱导的基因组不稳定性，从而导致肿瘤表型的发生。综上所述，SIRT4 是糖尿病、癌症及其他代谢疾病的新型治疗靶点。然而以SIRT4 为靶向的药物开发并没有取得实质性的进展[12-17]。所以作者拟采用巴斯德毕赤酵母表达体系，希望获得表达量高且有活性的SIRT4蛋白，为后期的高通量筛选方法打好基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 菌株与质粒 巴斯德毕赤酵母菌株 X33购自武汉普因特生物工程有限公司，感受态细胞TOP10购自索莱宝公司，pPICZA质粒购自Invitrogen 公司，PCMV-flag-SIRT4质粒来自贵州医科大学微生物与生化药实验室质粒库。

1.1.2 试剂与培养基 酵母氮源YNB(批号Y8040)、LB培养基(批号20160527)、YPD液体培养基(批号20170309)、YPDA固体培养基(批号20160708)、卡拉霉素(批号140B047)、ECL Plus超敏发光液(批号20151020)、彩虹蛋白Marker(批号PR1910)、考马斯亮蓝 R-250(批号416B0330)、PMSF(批号P8340)均购自索莱宝公司；酵母提取物(批号LP0021)购自OXOID公司，蛋白胨(批号170515)购自上海博微生物科技有限公司，抗生素Zeocine购自上海生物风公司，BMGY、BMMY参照Invitrogen 公司的毕赤酵母表达手册制备，DNA 15 000 bp Marker购自TaKaRa公司，色谱甲醇(批号67-56-2)购自天津市大茂化学试剂厂，BCA 蛋白浓度测试试剂盒(批号20151225)及限制性内切酶Fast DigestNotI、Fast DigestXhoI (批号 FD0593、FD0694)、T4 DNA Ligase连接酶(批号15224041)购于Thermo 公司，Pfu 和Taq 酶(批号KP201、KT201)购自大连宝生物公司，质粒抽提试剂盒(批号18116KA1)购自 AXYGEN公司，PCR引物由北京博迈德公司合成，HisTrapTMHP柱(批号10252565)购自GE公司，兔抗His-tag多抗(批号 RG001020)购自索莱宝公司，山羊抗兔IgG(H+L)HRP(批号AB00151)购自巴傲得生物科技有限公司，实验用多肽由上海沐晋公司合成。

1.1.3 仪器 酶标仪(伯乐公司，型号Model 680)，蛋白快速转印仪(伯乐公司，型号Trans-BlotTurbo)，凝胶成像仪(SYNGENE公司，型号 G-BOX)，蛋白电泳仪(伯乐公司，型号Mini Trans-Blot Cell)，蛋白核酸分析仪(赛默飞公司，型号Biomata 3s)，高速冷冻离心机(赛默飞公司，型号X3R)，涡旋振荡器(大龙牌，型号MX-S)。

1.1.4 引物信息 见表1。

表1 引物信息

25～314表示克隆从25位氨基酸对应的碱基序列开始，314位氨基酸结束；下划线为酶切位点

1.1.5 多肽信息 GDH-K(生物素酰化)的分子式为C86H124N22O25S，[M-2H]2-实测值为947.933 4。GDH-K(硫辛酰化)的分子式为C88H127N19O24S2，[M-2H]2-实测值为948.431 0。GDH的分子式为C76H110N20O23，[M-2H]2-实测值为834.393 9。

1.1.6 试剂配制 Buffer A：pH 8.0 Tris-HCl 20 mL、5 mol/L NaCl 100 mL，ddH2O定容至1 L；10×电泳液：30.3 g Tris、144.1 g 甘氨酸、10 g SDS，定容至1 L；转移液：3.03 g Tris、14.42 g 甘氨酸，150 mL甲醇定容至1 L；考马斯亮蓝染液：1.0 g R-250、500 mL甲醇、100 mL乙酸，定容至1 L；脱色液：500 mL ddH2O、400 mL甲醇、100 mL乙酸；100 mmol/L PMSF：0.017 4 g溶于1 mL异丙醇；1 mol/L咪唑：68.08 g 咪唑溶于1 L Buffer A，使用时逐级稀释；多肽用DMSO配制成浓度为10 mmol/L的母液，使用时稀释。

1.2重组质粒的构建及鉴定以PCMV-flag-SIRT4为模板，用特异性引物进行PCR，扩增目的基因。PCR程序：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，循环30次；72 ℃延伸 5 min。分别将pPICZA载体和扩增的SIRT4 PCR产物用NotⅠ和XhoⅠ进行双酶切，用T4 DNA ligase于22 ℃连接2 h。用热激法将连接产物转入到感受态细胞TOP10中，于37 ℃ 180 r/min振摇2 h，涂布于含有Zeocine的LB固体平板上，于37 ℃恒温培养箱培养过夜。挑取菌落于5 mL LB培养基(含Zeocine)37 ℃ 180 r/min振摇过夜，用试剂盒提取质粒，用载体引物对重组质粒进行PCR扩增，用10 g/L凝胶电泳验证。将阳性克隆送上海美吉公司进行基因测序。

1.3重组质粒电转将测序正确的重组质粒用BstXⅠ内切酶线性化，通过电转的方法将产物转入到巴斯德毕赤酵母X33感受态细胞中，于28 ℃放置2 h后，涂布于YPDA(含Zeocine)平板。30 ℃培养72 h，挑取单克隆与未转入质粒的X33菌落用特异性引物进行PCR扩增。PCR程序同1.2。

1.4SIRT4蛋白的表达及条件优化挑取测序正确的单克隆，接种于10 mL BMGY(含Zeocine)，30 ℃ 210 r/min培养48 h，于600 nm波长处测定D值在2.0～6.0之间。5 000 r/min收集菌体，用BMMY培养基重悬菌体后于600 nm波长处测定D值在0.8～1.0之间，30 ℃ 210 r/min培养96 h，每隔24 h添加甲醇至终浓度分别为体积分数1%、2%、3%、4%、5%，同时以未转质粒的X33 作为阴性对照进行同样操作。收集相同体积的菌体，高压破碎后12 000 r/min离心30 min，取上清 10 μL 加入5 μL 3×SDS Loading Buffer，97 ℃水浴中煮沸7 min，12 000 r/min、4 ℃离心5 min，用150 g/L的SDS-PAGE 电泳对其检测。后期选择最佳甲醇浓度对蛋白进行表达。

1.5SIRT4蛋白的表达及纯化根据1.4考察的最佳诱导条件对SIRT4进行蛋白表达。收集菌液，将菌液于4 ℃ 10 000 r/min 离心20 min，轻轻去掉上清液，沉淀用60 mL Lysis Buffer(含1 mmol/L PMSF)重悬，于1 000 Pa高压破碎，循环10次。12 000 r/min 离心30 min，保留沉淀，收集上清液，用镍柱HisTrapTMHP进行纯化，上样量60 mL，流速2 mL/min，以Buffer A缓冲液配制浓度为25、50、100、150、200、250、500 mmol/L的咪唑进行洗脱，通过电泳观察纯化效果。

1.6重组SIRT4蛋白的验证纯化后的目的蛋白分别取0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 μL，用水补足体积至10 μL，加入 5 μL 3×SDS Loading Buffer 混匀，置于97 ℃水浴中煮5 min，12 000 r/min、4 ℃离心5 min，经 SDS-PAGE 凝胶电泳，通过半干转(25 V、30 min)转到 PVDF 膜上，加入4 mL体积分数为5%的BSA封闭2 h，用TBST洗4次，5 min/次，加入用体积分数为5%的BSA稀释后的一抗于4 ℃孵育过夜，用TBST洗4次，5 min/次，再加入用TBST稀释后的二抗室温孵育2 h，用TBST洗4次，10 min/次，将膜取出加入 0.3 mL的ECL Plus 超敏发光液，立即进行显影。

1.7重组SIRT4蛋白的活性验证SIRT4蛋白的活性反应处理体系为：1 mmol NAD、1 mmol DTT、20 mmol Tris-HCl、10 mol SIRT4蛋白、167 mol GDH-K多肽，37 ℃孵育1 h，用Quench Buffer猝灭反应，于4 ℃ 10 000 r/min 离心20 min，取上清50 μL进行质谱检测。

2 结果

2.1质粒的构建与鉴定质粒构建完成后，用载体引物进行PCR扩增验证，结果显示，跟空载体对比，实验组增加了约900 bp的基因片段(图1)。将阳性克隆送上海美吉公司进行测序，测序结果与目的基因模板匹配(GenBank序列号AAD40852.1)。

M：Marker；1：空质粒；2～11：挑取的10个单克隆

2.2重组质粒电转及鉴定将电转入质粒的菌落进行PCR，电泳结果显示，转入pPICZA-SIRT4质粒在1 000 bp下方均明显扩增条带，且相对分子质量与预期相同(图2)。将阳性克隆提基因组，送上海美吉公司进行测序，测序结果与SIRT4基因模板匹配。

M：Marker；1：阴性对照；2：阳性对照；3～8：6个不同单克隆菌落

图2菌落PCR结果

2.3重组SIRT4蛋白的表达及条件优化结果(图3)显示，加入甲醇后在33 000处有一条明显的目的条带，且甲醇为体积分数2%时的效果最好。

M：Marker;1：不加甲醇;2～6:分别为加入体积分数1%、2%、3%、4%、5%甲醇

图3甲醇浓度考察结果

2.4重组SIRT4蛋白的表达及纯化结果(图4)显示，编号9、10两管纯化效果较好，测定其浓度为3.2 g/L，表达量约为每升发酵液8.0 mg。

M：Marker；1：破碎后上清混悬液；2：过柱液；3：Buffer A冲洗；4～13：分别为25、50、100、100、150、150、200、200、250、500 mmol/L咪唑洗脱

图4SIRT4纯化结果

2.5重组SIRT4蛋白的验证结果见图5。可知，检测到目标蛋白的His标签，表明SIRT4成功在毕赤酵母X33中表达。

1～6：分别为0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 μL SIRT4蛋白；7：阳性对照

图5重组蛋白SIRT4的Westernblot结果

2.6重组SIRT4蛋白的活性验证将处理后的蛋白多肽反应体系用质谱进行检测，能分别同时从反应体系的总离子流图里面提取到生物素酰化和硫辛酰化的产物GDH，说明表达的SIRT4蛋白有一定的去生物素酰化和去硫辛酰化活性。

3 讨论

在分子克隆的时候，由于SIRT4目的基因末尾带有TGA终止密码子，为了不影响载体上His标签的表达，作者在设计下游引物的时候，去掉了TGA终止密码子，另外考虑到克隆全长基因会影响蛋白的活性，所以作者是从25位氨基酸对应的碱基序列开始设计上游引物。后期作者对蛋白表达的条件进行了优化，结果显示，在甲醇为体积分数2%时诱导效果最佳，1 L发酵液经纯化后可得到8.0 mg SIRT4蛋白。并且作者对酵母表达的SIRT4蛋白进行了活性检测，从质谱结果来看，酵母表达的SIRT4蛋白有一定的去生物素酰化和去硫辛酰化活性，这些都为后面建立筛选方法提供了基础。