食管癌中MicroRNA-149与DNA聚合酶β的靶向关系

张 满，李 敏，赵国强

郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室 郑州 450001

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长18～24个核苷酸的小型非编码单链RNA，通过与靶基因mRNA的3’端非编码区(3’UTR)特异性结合，可在转录和翻译水平调节基因的表达，进而发挥生物学效应[1]。研究[2-3]显示miRNA在癌症发生、发展过程中起重要作用，部分发挥癌基因的作用，而部分发挥抑癌基因的作用。DNA聚合酶β(DNA polymerase，polβ)是DNA聚合酶家族的主要成员，参与DNA碱基切除修复(base excision repair，BER)[4-6]，其表达与一些恶性肿瘤的发生、发展及预后关系密切[7-9]。我们通过生物信息学分析发现polβ 3’UTR存在miRNA(miR)-149结合位点，但miR-149在食管癌中对polβ是否存在调节作用，尚不清楚。为此，本研究拟对64例食管癌标本中miR-149和polβ的表达水平进行检测，并利用双荧光素酶报告实验和Western blot实验探讨食管癌EC9706细胞中polβ与miR-149的靶向关系。

1 材料与方法

1.1主要材料食管癌细胞EC9706购自上海中科院细胞库。质粒pmirGLO、双荧光素酶测定试剂盒均购自 Promega公司。Trizol试剂、LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测试剂盒购自Stratagene公司。胎牛血清、RPMI 1640培养基、反转录试剂盒均购自Thermo公司。BCA蛋白测定试剂盒购自Beyotime公司。抗体均购自Santa Cruz Biotechnology公司。化学发光检测试剂盒购自Amersham Pharmacia Biotech公司。miR-149 mimics和miR-149 scramble购自GenePharma公司。

1.2食管癌和癌旁正常组织中miR-149和polβmRNA的检测收集2014年到2015年在郑州大学第一附属医院和林州市肿瘤医院收治的食管癌患者手术切除的癌组织及其相应的癌旁正常组织标本，共64对。本研究由郑州大学伦理委员会批准。使用Trizol试剂从组织标本中提取总RNA，反转录得cDNA。根据 miR-149 碱基序列设计特定反转录引物，polβ引物为通用引物。反转录条件为：16 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min，16 ℃终止。然后以cDNA为模板进行PCR。根据试剂盒说明书配制PCR体系。PCR反应条件：预变性94 ℃ 3min；94 ℃ 20 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 20 s，40个循环；94 ℃ 3 min,16 ℃终止。实验步骤严格按照试剂盒说明书进行。U6 snRNA为miR-149的内参，β-actin为polβ的内参。miR-149和polβ mRNA表达水平采用2-ΔΔCt法计算。

1.3miR-149靶基因的生物信息学预测利用TargetScan和miRanda软件，分析预测miR-149与polβ的可能结合位点。

1.4转染miR-149的EC9706细胞中polβ蛋白的检测将EC9706细胞均匀铺于6孔板，用含有体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37 ℃和体积分数5%CO2条件下培养过夜，待细胞长至融合度达70%～80%时用于实验。实验分为3组：空白对照组、miR-149组和阴性对照组，每组3个复孔。空白对照组只加入LipofectamineTM2000，miR-149组利用LipofectamineTM2000转染miR-149 mimics，阴性对照组利用LipofectamineTM2000转染miR-149 scramble。转染前换新鲜的DMEM培养液，转染后继续培养6 h，弃去原细胞培养液，加入新鲜的含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养48 h。然后分别收集3组细胞，提取总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。将提取的蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后转移到PVDF膜上，封闭，4 ℃下加一抗多克隆兔抗人polβ(稀释度11 000)孵育过夜，洗涤，加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(稀释度13 000)孵育2 h。以β-actin作为内参，使用化学发光检测试剂盒在成像系统(美国ProteinSimple公司，FC-M型)下观察，并进行定量分析。

1.5双荧光素酶报告实验①野生型(Wt)polβ 3’UTR双荧光素酶报告质粒的构建：以人类基因组DNA为模板，PCR扩增含有miR-149推定结合位点的人Wt-polβ 3’UTR片段，将Wt-polβ 3’UTR克隆到pmirGLO报告载体中，将重组 pmirGLO质粒转化到大肠杆菌感受态DH5α中培养，随机挑取阳性菌落进行PCR鉴定，经测序证实得到重组质粒pmirGLO-Wt-polβ 3’UTR。②使用BTX ECM 2001电穿孔仪，将miR-149 mimic和pmirGLO-Wt-polβ 3’UTR、miR-149 scramble和pmirGLO-Wt-polβ 3’UTR共转染EC9706细胞，培养24 h后，用双荧光素酶测定试剂盒测定荧光素酶活性。实验重复3次。双荧光素酶活性检测使用的仪器是德国 Berthold 公司的多功能微孔板测读仪(Centro XS③LB 960)。

1.6统计学处理采用SPSS 21.0进行统计学分析。对食管癌和癌旁正常组织中miR-149和polβ mRNA表达水平进行Pearson相关分析；3组细胞中polβ蛋白表达水平的比较采用单因素方差分析和LSD-t法检验，对双荧光素酶报告实验结果进行两独立样本t检验；检验水准α=0.05。

2 结果

2.1食管癌组织中polβmRNA和miR-149的表达情况qRT-PCR结果显示，以癌旁正常组织表达水平为1，癌组织中polβ mRNA表达水平为(2.8±0.4)，miR-149表达水平为(0.4±0.1)。Pearson相关分析显示：癌组织中polβ mRNA和miR-149表达水平呈负相关(r=-0.671，P<0.001)。

2.2生物信息学预测结果结果(图1)显示，polβ的3’UTR区和miR-149存在结合位点。

图1 miR-149在polβ 3’UTR区的预测结合位点

2.3转染miR-149的EC9706细胞中polβ蛋白的表达空白对照组、阴性对照组和miR-149组polβ蛋白表达水平分别为(1.207±0.143)、(1.038±0.117)和(0.541±0.062)，3组比较差异有统计学意义(F=28.461，P<0.001),miR-149组polβ蛋白表达水平低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05)，提示上调miR-149表达可抑制EC9706细胞中polβ蛋白的表达。

2.4双荧光素酶报告实验结果重组质粒pmirGLO-Wt-polβ 3’UTR的测序结果显示，插入的片段与预期完全一致(图2)。miR-149 mimic和pmirGLO-Wt-polβ 3’UTR共转染组EC9706细胞中荧光素酶活性(0.513±0.022)，miR-149 scramble和pmirGLO-Wt-POLβ 3’UTR共转染组为(1.090±0.125)，前者较后者降低(t=7.895,P<0.001)，说明polβ是miR-149的靶基因。

图2 重组质粒pmirGLO-Wt-polβ 3’UTR测序结果

3 讨论

研究[10-13]发现，polβ在结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、脑胶质瘤、卵巢癌和胃癌等多种肿瘤组织中存在高表达的现象。Polβ的高表达可引起细胞自身突变率增加，可能参与了肿瘤细胞的损伤修复、增殖，可增强某些肿瘤细胞对放化疗的耐受性，导致复发风险提高[14-15]。在食管癌组织中，polβ表达水平高于正常组织，并且影响肿瘤的发生、发展进程[16]。另外，polβ高表达可导致食管癌细胞对化疗药顺铂敏感性降低[15-18]。本实验结果显示，食管癌组织中polβ mRNA表达水平明显高于癌旁正常组织，miR-149表达水平明显低于癌旁正常组织，且癌组织中polβ mRNA和miR-149表达水平呈负相关。本研究结果提示，食管癌组织中 miR-149的低表达可能是polβ mRNA高表达的原因之一。

miR-149在肝癌、胶质瘤、肾细胞癌、乳腺癌等肿瘤组织中表达水平均明显低于正常组织[19-25]。上调肝癌组织中miR-149的表达可抑制癌细胞的迁移和侵袭[20-22]。上调miR-149-5p的表达可抑制肾癌细胞的增殖和迁移，并促进细胞凋亡，表明miR-149-5p可能在肾细胞癌中起着肿瘤抑制剂的作用[23]。在神经胶质瘤组织中miR-149的表达与患者的预后密切相关，提示其具有潜在的临床意义[24-25]。Warnecke-Eberz等[26]研究发现，食管腺癌中miR-149相对于正常组织低表达。本研究结果显示，上调食管癌细胞EC9706中miR-149的表达可抑制polβ蛋白的表达，miR-149可通过结合polβ 3’UTR下调polβ的表达。miR-149低表达可能是食管癌发生、发展的重要原因之一。

综上所述，食管癌中miR-149与polβ存在靶向关系，miR-149可能通过结合polβ 3’UTR下调polβ的表达，从而在食管癌的发生发展中发挥重要作用。