Bcl-2抑制剂TW37联用紫杉醇对EC9706细胞增殖和凋亡的影响

刘卫华，秦甜甜，李蕾蕾，张雪燕，霍峻锋，石晓丽，王 淙

郑州大学药学院 郑州 450001

食管鳞状细胞癌是食管癌的主要组织学亚型，主要发生在非洲南部和东部、日本及中国某些地区；晚期疾病患者的5 a生存率低于20%[1]。Bcl-2蛋白家族已经被证实在多种肿瘤组织中的表达发生改变，尤其是Bcl-2、Bcl-xl等[2]。因此，本实验验证常规抗癌药物紫杉醇(PTX)与Bcl-2抑制剂TW37联用能否有效抑制食管癌EC9706细胞的增殖，为临床食管癌的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1细胞及试剂食管癌EC9706细胞株购自中国科学院细胞库(中国上海)，由郑州大学药物研究院保存。RPMI 1640培养基、胰蛋白酶消化液及结晶紫染液(北京索莱宝科技有限公司)，标准胎牛血清(以色列BI公司)，凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)，MTT粉(美国BD公司)。

1.2细胞培养EC9706细胞培养于RPMI 1640培养基中，每500 mL培养基补充50 mL胎牛血清。细胞在体积分数为5% CO2、37 ℃环境中培养，隔天传代或更换培养基，取对数生长期细胞用于后续实验。

1.3MTT法检测细胞增殖抑制率消化、收集EC9706细胞，用完全培养基稀释后以每孔4 500个细胞的密度均匀接至96孔板中。细胞过夜后加入PTX、TW37或同时加入2种化合物(浓度均为0.20、0.40、0.80、1.60、3.20、6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/L)作为实验组，另设空白实验组和阴性对照组。48 h后，每孔加入20 μL MTT(500 mg/L)。反应4 h后吸弃上清，每孔加入150 μL DMSO后摇床振荡10 min，酶标仪在570 nm处测定吸光度值。实验结果用于确定后续实验浓度。增殖抑制率(%)=(对照孔吸光度值-实验孔吸光度值)/(对照孔吸光度值-空白孔吸光度值)×100%。实验重复3次。

1.4细胞克隆形成率的测定每孔1×103个EC9706细胞均匀接种到6孔板中。细胞过夜后每孔加入0.8 μmol/L PTX、0.8 μmol/L TW37或者同时加入0.8 μmol/L PTX和0.8 μmol/L TW37，持续培养7 d，每3 d更换一次含药培养基。以不加药物的细胞作为对照。7 d后每孔加入1 mL甲醇固定30 min。PBS洗去固定液后加入结晶紫染色30 min，纯净水洗至无背景后室温风干，采用Image J软件计算细胞克隆形成率。实验重复6次。

1.5细胞凋亡率的测定EC9706细胞接种到6孔板中，细胞过夜后加入含0.8 μmol/L PTX、0.8 μmol/L TW37或两者联合的培养基，加入不含药物的完全培养基作为对照。24 h后，使用不含EDTA的胰蛋白酶消化、离心并收集细胞，每孔细胞分别加入500 μL 1×Binding Buffer、5 μL Annexin V和PI混匀后避光染色15 min。上流式细胞仪进行检测。实验重复3次。

1.6统计学处理采用SPSS 20.0进行数据分析。不同组间细胞克隆形成率、细胞凋亡率的比较均采用析因设计的方差分析。检验水准α=0.05。

2 实验结果

2.1PTX单用或联用TW37对EC9706细胞增殖抑制率的影响结果见图1。可知，随给药浓度增加，PTX及TW37联用对EC9706细胞有明显的增殖抑制作用。后续实验采用0.8 μmol/L化合物联用。

图1 PTX单用或联用TW37对EC9706细胞增殖抑制率的影响

2.2PTX单用或联用TW37对EC9706细胞克隆形成率的影响结果见图2及表1。可知，PTX或TW37对细胞的平板克隆形成有一定抑制作用；PTX联合TW37使用时可以使细胞增殖能力减弱。

A：对照组；B：PTX组；C：TW37组；D：TW37+PTX组

表1 各组EC9706细胞克隆形成率比较%

FPTX=205.244，FTW37=234.365，F交互=375.787,P均<0.001

2.3PTX单用或联用TW37对EC9706细胞凋亡率的影响结果见表2。可知，任一化合物单用或2个化合物联用均可以使细胞凋亡率增加。

表2 各组EC9706细胞凋亡率比较 %

3 讨论

TW37是使用基于结构的设计策略设计的新型非肽小分子抑制剂，靶向Bcl-2中的BH3结合槽，抑制凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1的表达，有研究[3-4]表明TW37对Bcl-2蛋白具有高亲和力。Bcl-2蛋白是一种在多种肿瘤组织中表达上调的抗细胞凋亡蛋白，其表达水平与治疗耐药性和预后差密切相关[5-6]。TW37可抑制肺癌H1975细胞生长并且通过抑制AKT信号传导途径诱导细胞凋亡[7]。因此作者考虑TW37与PTX联用，增强PTX疗效，以期降低剂量并减少不良反应。

PTX是世界上使用最广泛的化疗药物之一，PTX通过干扰微管蛋白聚合-解聚过程，进而阻碍肿瘤细胞的有丝分裂，引起细胞周期阻滞，最终导致细胞凋亡，是一类极具前景的抗肿瘤药物[8]。PTX在临床上用于治疗头颈部癌、食管癌、胃癌等。有研究[9]表明PTX对免疫细胞，包括效应性T细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞等具有广泛调节作用，PTX杀伤肿瘤细胞的同时可以逆转肿瘤的免疫逃逸。因此，对于许多类型的癌症，PTX都是一线化疗药物，包括卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和食管癌等[10]。但是，长期广泛用药也存在很多问题，如胃肠道反应、过敏、心脏毒性和耐药性等。因此，与其他药物联用，增强PTX的疗效，降低PTX的使用剂量，可以有效减轻不良反应。

在本研究中，作者评估了Bcl-2抑制剂TW37联合抗癌药物PTX对食管癌细胞的增殖抑制作用。作者观察到，TW37和(或)PTX作用于EC9706细胞48 h后，细胞增殖抑制率逐渐升高。另外，2种化合物联用还能抑制细胞克隆形成，诱导细胞凋亡。因此，TW37联合PTX可作为食管癌治疗的新策略。