小鼠T279基因敲除胚胎干细胞的构建

杨 超，王朝亮，张天标，殷正伟，王 瑞

郑州大学第一附属医院泌尿外科 郑州 450052

不育已成为世界范围的生殖难题[1]。不育症的发生与睾丸特异性基因密切相关[2-4]。T279是我们实验室首次鉴定出的一个睾丸特异性表达新基因，其仅在小鼠睾丸组织中特异性表达，人和小鼠T279基因的核苷酸序列有64.5%的同源性，说明T279是一个人-小鼠同源性基因；前期的研究[5]证实T279蛋白在无精症患者睾丸组织中的表达减少或消失。为从整体水平探索T279基因在精子发生中的功能和相关机制，作者利用打靶载体技术构建了小鼠T279基因敲除胚胎干细胞(ES细胞)模型，为进一步建立T279基因敲除小鼠模型奠定了基础。

1 材料与方法

1.1材料含T279基因的129 BAC质粒(编号bMQ-355C23)购于Geneservice公司；PL253、PL452质粒由 (美国)国立癌症研究所惠赠；DH5α、EL350大肠杆菌及小鼠129品系原代ES细胞由本实验室保存。限制性核酸内切酶(NotⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅤ、KpnⅠ)，PrimeSTAR HS DNA 聚合酶，T4 DNA 连接酶，碱性磷酸酶(CIAP)购自TaKaRa生物公司；氯霉素、卡那霉素、氨苄青霉素购自上海生工生物工程有限公司；Biospin PCR产物纯化试剂盒、Biospin切胶回收试剂盒购自杭州博日科技有限公司；Tryptone、Yeast extract购自英国OXOID公司；质粒中抽试剂盒购自Promega公司；DMEM、胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；丝裂霉素 C、G418、更昔洛韦购自Sigma公司；PBS、Southern blot转膜液、预杂交液、杂交液、洗膜液由本实验室配制；Zeta-probe Blot膜购自Bio-Rad公司；α-P32-dCTP购自PerkinElmer公司。

1.2PCR引物和Southernblot探针引物根据129 BAC质粒序列分析结果，结合小鼠T279基因序列(GenBank登录号：NM_024279)，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0软件设计5对引物。引物由南京金丝瑞生物科技有限公司合成。T279-1F：5’-ATAAGAATGCGGCCGCCACTCGATGACAGAACAAA

TCC-3’，T279-1R：5’-CCCAAGCTTCTTCTCTCTGCTGAAAGGACAG-3’ ，用来扩增Retrieving-5’同源臂，并分别引入NotⅠ和HindⅢ酶切位点。T279-2F：5’-CCCAAGCTTGTTCCACAGGAGAAAGTGGTTC-3’，T279-2R：5’-CGGGATCCACATCAGTGACTTGGAGCT GTG-3’ ，用来扩增Retrieving-3’同源臂，并分别引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位点。Lxp-F：5’-CTCAGGGTGCCAGGGGAAATCCTGGTTTCCACAGACACAGCTGCTCCGTGGGTAACGCCTTGCCCATCTTGATATCGCAGCCCAATTCCGATC ATA-3’，Lxp-R：5’-CAGGGGAGGCTGTGAGGAGACAGTTGTCTCACACTGTGCTGTCCTCCCATGTTGCTCCTGTGAGGCAGGCGAGCTCGG TACCGCTCTAGAACTAGTGGAT-3’ ，用来扩增loxp-neo-loxp片段，并分别引入EcoRⅤ和KpnⅠ酶切位点。EcoRⅤ-F：5’-AGCCACAGCTATGGAGAGT GATC-3’，EcoRⅤ-R：5’-GAGATTGGTCCCTGGA CAGTG-3’ ，用来扩增5’端Southern blot 探针。KpnⅠ-F：5’-CTGCATGTGAGACACTCACCAG-3’，KpnⅠ-R：5’-CCATTCTTCTGCCAGCACTGAC-3’，用来扩增3’端Southern blot 探针。

1.3基因敲除策略小鼠T279(GenBank登录号：NM_024279)基因定位于染色体8A2位点，含7个外显子，编码一个含182个氨基酸、相对分子质量为19 940 的蛋白。由于外显子1、2之间以及外显子5、6之间内含子超过8 kb，不易操作，所以我们决定敲除外显子2～5，共8 333 bp。见图1。

图1 小鼠T279基因敲除策略

1.4PL253-T279小载体的构建提取129 BAC质粒DNA，分别用两对引物T279-1F、T279-1R和T279-2F、T279-2R扩增Retrieving-5’及 Retrieving-3’ 同源臂。PCR反应体系如下：PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(2.5 u/μL) 0.5 μL、dNTP 混合物(2.5 mmol/L) 4 μL、10 μmmol/ L上下游引物各 1 μL、5×PrimeSTAR buffer(Mg2+plus)10 μL、BAC-DNA 1 μL、MilliQ 水32.5 μL。PCR程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；最后72 ℃延伸5 min。上述PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定、切胶回收后，用NotⅠ+HindⅢ酶切Retrieving-5’同源臂，用HindⅢ+BamHⅠ酶切Retrieving-3’同源臂。同时用NotⅠ+BamHⅠ酶切PL253质粒并回收PL253大片段。将上述酶切回收后的Retrieving-5’ 同源臂、Retrieving-3’ 同源臂、PL253大片段用T4连接酶连接，连接产物经HindⅢ线性化后电转染到含129 BAC质粒的EL350菌中，在Retrieving-5’及 Retrieving-3’同源臂的介导下，129 BAC质粒与PL253连接产物发生同源重组，同源重组正确的即为PL253-T279小载体，见图2。

图2 同源重组正确的PL253-T279小载体

1.5PCR扩增loxp-neo-loxp片段提取PL452质粒DNA，用引物Lxp-F、Lxp-R PCR扩增loxp-neo-loxp片段，并分别引入70 bp同源臂LxpF和LxpR以及EcoRⅤ和KpnⅠ酶切位点。反应体系如下：PrimeSTAR HS DNA 聚合酶 (2.5 u/μL) 0.5 μL、dNTP 混合物 (2.5 mmol/L) 4 μL、8 mmol/L上、下游引物Lxp-F、Lxp-R 各1 μL、5×PrimeSTAR buffer(Mg2+plus)10 μL、BAC-DNA 1 μL、MilliQ 水32.5 μL。PCR程序：95 ℃预变性5 min；98 ℃变性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸150 s，30个循环；最后72 ℃延伸5 min。经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后切胶回收PCR产物。

1.6T279打靶载体的构建通过电转染方法将loxp-neo-loxp片段电转染到含PL253-T279小载体的EL350菌里，在LxpF和LxpR同源臂的介导下，PL253-T279和loxp-neo-loxp片段发生同源重组。将电转染后的菌液接种到氨苄青霉素LB平板，经过无菌培养后提取DNA，然后用KpnⅠ酶切鉴定发生了同源重组的克隆，选择性扩增后提取DNA，再次用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定，筛选T279打靶载体构建正确的克隆。见图3。

图3 构建正确的T279打靶载体

1.7电转染ES细胞取小鼠129品系原代ES细胞，经传代后用含质量分数10%FBS-DMEM和10 mg/L丝裂霉素C 37 ℃处理2～3 h。计数稀释后铺到用质量分数0.1%生物胶预处理过的10 cm培养皿上，制成饲养层细胞。经Trypsin/EDTA消化处理后用PBS重悬，调整细胞密度为1×107mL-1。取0.8 mL细胞悬液，加入25 μg线性化的打靶载体，在240 Ⅴ、500 μF条件下电转染。将电转染后的ES细胞转到含有饲养层的培养皿中，24 h后换成筛选培养液(含G418 200 mg/L、更昔洛韦2.5 μmol/L)。筛选培养8～10 d后挑取细胞克隆于96孔板中，1 ∶3传代，其中一板用于鉴定，另外两板冻存。

1.8T279基因敲除ES细胞的鉴定提取抗性筛选后的细胞基因组DNA，PCR法扩增5’端及3’端同源臂，初步筛选发生了同源重组的ES细胞。选择性扩增培养初步筛选阳性的细胞克隆，提取基因组DNA后，EcoRⅤ酶切消化用于Southern blot 5’端鉴定，KpnⅠ酶切消化用于Southern blot 3’端鉴定。酶切反应体系：80 μL 基因组DNA，10 μL 10×H(10×L)Buffer，10 μLEcoRⅤ(KpnⅠ)，37 ℃水浴8 h。10 g/L琼脂糖凝胶电泳(40 V、8 h)，用虹吸转移法将产物转移到Zeta-probe blot膜上。65 ℃预杂交3 h，杂交12 h，洗膜3次，每次15 min，最后-80 ℃X线片曝光72 h，洗片。

2 结果

2.1PL253-T279小载体的构建引物T279-1F、T279-1R和T279-2F、T279-2R PCR均扩增出特异Retrieving同源臂，条带大小与预期一致，长度分别为455 bp和570 bp，测序结果与预期一致。Retrieving同源臂和PL253质粒大片段的连接产物电转染到EL350菌后，涂板、提取DNA，KpnⅠ+NotⅠ酶切结果表明129 BAC质粒与PL253同源臂载体发生了正确的同源重组，PL253-T279小载体构建成功。见图4。

M：Marke；1～6酶切结果

2.2T279打靶载体的鉴定loxp-neo-loxp片段电转染到含PL253小载体的EL350菌之后，取电转染后的菌液涂板、培养，提取DNA，KpnⅠ酶切结果表明有两个同源重组阳性克隆存在，分别编为1号、2号。扩增这两个克隆，提取DNA后，再次用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定，结果见图5。BamHⅠ酶切T279打靶载体后产生3条阳性条带分别为11 516、3 801、1 067 bp；EcoRⅠ酶切T279打靶载体后产生3条阳性条带分别为8 813、5 507、2 264 bp。上述酶切条带大小与预期结果一致，说明T279打靶载体构建成功。

1、2：BamHⅠ酶切结果；3、4：EcoRⅠ酶切结果

2.3小鼠T279基因敲除ES细胞的鉴定经G418/更昔洛韦正负筛选的ES细胞克隆经PCR扩增5’端和3’同源臂，初步筛选得到1个同源重组阳克隆，编号10H(图6，PC代表阳性对照、129代表阴性对照)。扩增培养10H号克隆，提取基因组DNA，分别进行5’端 和3’端Southern blot鉴定(图7)。在5’端的鉴定中，10H号克隆在7.5 kb和5.9 kb位置均有一条带，阴性对照仅在7.5 kb处有一条带；在3’端的鉴定中，10H号克隆在17.6 kb和7.5 kb位置均有一条带，阴性对照仅在17.6 kb处有一条带。从上述Southern blot结果可知10H号克隆为同源重组的小鼠T279基因敲除ES细胞。

图6 5’端和3’同源臂PCR初步筛选ES细胞同源重组阳性克隆

图7 ES细胞基因组DNA Southern blot 鉴定

3 讨论

基因敲除技术是目前从整体水平研究特定基因功能的主流技术。从20世纪90年代至今，国内外学者利用基因敲除技术建立了许多目的基因缺失动物模型，为生物医学的发展做出了巨大的贡献。近年来发展起来的大肠杆菌同源重组系统和129品系BAC文库末端测序的完成使得基因敲除技术突破了传统上打靶载体构建时受基因组DNA上限制性内切酶位点限制的局限，使得打靶载体构建变得高效、省时、灵活。

我们实验室在构建T279打靶载体的过程中兼顾了以下几个方面的问题：① 同源臂长度的选择。前人的研究[6]表明打靶载体同源臂的长度对打靶效率的影响很大，一般认为同源重组效率与同源臂的长度成正比[7-8]，但是PCR扩增长片段序列容易引入突变。我们本次打靶载体的构建在大肠杆菌同源重组系统内进行，最终打靶载体5’ 端同源臂长4.3 kb, 3’ 端同源臂长5.0 kb，从而保证了同源重组的效率。②同源臂序列的正确性。经PCR方法得到Retrieving同源臂，经酶切验证和测序，确认同源臂序列准确无误。 ③T279打靶载体的正确性。T279打靶载体构建出来后首先用KpnⅠ酶切，初步筛选到两个同源重组阳性克隆，扩增培养这两个克隆，提取基因组DNA后，再次用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切验证，确保所筛选到的同源重组阳性克隆准确无误。④129 BAC质粒与ES细胞的同源性。Retrieving同源臂是以129 BAC质粒为模板通过PCR扩增得到的，后期电转染所用的ES细胞也来自于小鼠129品系，同源臂与靶基因同源提高了同源重组发生的频率。

T279在无精症患者睾丸中的表达减少或消失[5]，我们推测T279与哺乳动物的精子发生过程密切相关。精子发生是大量睾丸特异性基因按时空顺序表达，并与睾丸组织内外环境共同作用的结果。CERM[9]、Hlt[10]、tesmin[11]、Cdc2[12]、hDmcl[13]等皆被证明为睾丸特异性基因并在精子发生过程中起重要作用。这些基因参与了小鼠精子发生过程中的染色质包装、染色质调控[14]、精子尾巴形成、能量代谢、顶体形成、透明带结合和信号传导[15]等。分析这些基因的组织表达特点、探讨其特殊功能，将有助于明确这些基因在精子发生过程中的作用，为生精障碍患者寻找新的生物治疗靶点。该研究中我们成功构建了T279基因敲除打靶载体，为T279基因敲除小鼠模型的建立奠定了基础，对于研究T279基因的生理特性和功能，理解精子发生的内在机制、防治由精子异常引起的不育及研制男性避孕药等具有重要意义。