郑州市冬季雾霾空气中细菌的多样性及耐药性检测

李梦臣，刘俏丽，段广才，晋乐飞，李 影，孙甜甜，吴慧颖，党德建，刘慧莹，徐亚珂，陈帅印，郗园林

1)郑州大学公共卫生学院流行病学教研室 郑州 450001 2)郑州大学公共卫生学院环境卫生学教研室 郑州 450001

近年来，我国部分城市和地区的雾霾愈发严重，引起了广泛的社会关注。据以往研究[1]报道，雾霾天气多出现在秋冬季节，而夏季较少见。人体暴露于雾霾中，会使免疫系统受到抑制，从而引起慢性肺部疾病，还会增加人群心脑血管疾病的死亡风险[2-3]。雾霾中空气微生物的数量多达上千种[4]，雾霾越严重的空气中含有的致病微生物就越多，这也是雾霾天气人群患病人数增加的主要原因。有研究[5]认为抗生素是治疗细菌感染性疾病的有效药物，但近年来细菌对抗生素的耐药性有所增加，耐药问题越来越引起重视。课题组前期研究[6]结果显示，郑州市城区空气细菌浓度地理分布呈现城区中心高于城市外围的特点，且城市中心附近人流密度大、空气质量较差，对雾霾天气细菌种类的研究具有突出性，故本研究选取地理位置分布较集中的4处采样点对郑州市冬季雾霾空气中细菌的多样性和耐药性进行分析，了解不同区域细菌种属类型的差异，通过药敏试验进一步反映抗生素的临床用量，为抗生素的合理应用提供思路。

1 对象与方法

1.1采样地点与时间参照郑州市城区空气质量信息发布系统中城区空气质量监测点，选取4个不同方位的地点作为采样点：郑州市卷烟厂(简称烟厂，位于紫荆山路与陇海路交叉口附近)；郑州大学第一附属医院(简称一附院，位于中原路与大学路交叉口附近)；郑州纺织机械厂(简称郑纺机，位于南阳路与黄河路交叉口附近)；郑州市环境保护局(简称市环保局，位于中原路与秦岭路交叉口附近)。于2016年12月至2017年2月，每月21日下午15:00～17:00在选定的采样点进行细菌采集。每月分别于4个采样点进行空气细菌采样，采样平板于37 ℃恒温培养箱中培养48 h后计数。采样当天温度、湿度如下，2016年12月21日：2～7 ℃、23%～42%；2017年1月21日：-5～9 ℃、12%～28%；2017年2月21日：5～17 ℃、13%～32%。

1.2主要试剂与仪器M-H培养基、LB培养基(英国Oxoid公司)；药敏纸片(杭州滨和微生物试剂有限公司)；细菌DNA小量提取试剂盒(上海莱枫生物科技有限公司)；LabCycler PCR仪(德国SensoQuest公司)；16S rRNA引物(上海生工生物工程有限公司)；HI8564 便携式温湿度计( 上海精密仪器仪表有限公司) ； ETW-6型六级筛孔撞击式微生物采样器(江苏金坛市亿通电子有限公司)。

1.3采样方法与计数使用ETW-6型六级筛孔撞击式微生物采样器以无菌式操作进行采样，在普通营养琼脂平板上对细菌计数[7]。烟厂、一附院、郑纺机、市环保局均采用扇形布点法，均设5个采样点(每点重复3次，取其平均值)。该取样器采样高度1.5 m，采样流量28.3 L/min，采样时间 5 min，采样体积为141.5 L。将采样后的培养板于37 ℃培养48 h，计数各级平板上的菌落数。采样同时，温湿度检测仪对空气温度、 湿度进行检测。

1.4细菌的分离与鉴定将采集到的空气中细菌样本统计、分析后，经生化反应初步筛选，挑取样本进行分离纯化，PCR扩增并测序。通过BLAST将获得的 DNA 序列与 GenBank 中的序列比对，鉴定细菌的属性[8-9]。

1.5K-B纸片法进行药敏检测药敏实验用纸片琼脂扩散法[10]，选用氨苄西林、庆大霉素、环丙沙星、头孢曲松、头孢哌酮、复方新诺明等。操作及结果判断严格按照美国临床和实验室标准协会抗菌药物敏感性试验标准(CLSI)[11]。

2 结果

2.1郑州市4个区的细菌浓度变化结果见表1。参照中科院生态研究中心发布的大气微生物评价分级标准[12]进行评价。12月份一附院采样点属于较清洁级(1 000～2 500 cfu/m3)，其余时间各采样点空气细菌浓度均属于清洁级(<1 000 cfu/m3)。4个采样点12月份的细菌浓度均高于其他月份。

表1 各采样点空气细菌浓度 cfu/m3

2.2雾霾空气细菌的分类与鉴定结果见表2。鉴定出的细菌以杆菌为主，其中蛾微杆菌和芽孢杆菌共25株，葡萄球菌1株，志贺菌 1 株，假单胞菌 1株。鉴定出所有菌与已知菌的同源性均在96%以上，且大多为条件致病菌，在正常条件下不会导致传染类疾病的发生。烟厂区域检出假单胞菌1株(14%)、芽孢杆菌6株(86%)；一附院区域检出志贺菌1株(15%)、葡萄球菌1株(14%)、芽孢杆菌4株(57%)、蛾微杆菌1株(14%)；郑纺机和市环保局区域检出有芽孢杆菌各7株(100%)。

表2 菌株分子生物学鉴定结果

续表2

2.3耐药性分析28株细菌对氨苄西林、庆大霉素、环丙沙星、头孢曲松、头孢哌酮、复方新诺明等的耐药率依次为7.1%、0%、0%、17.9%、7.1%、0%。检测结果见表3。

表3 雾霾空气细菌的耐药性分析

R：耐药，I：中介，S：敏感

3 讨论

4个区域的细菌浓度显示，郑州市冬季雾霾空气中细菌含量处于相对清洁的程度，刚入冬季时细菌浓度较高，应注意避免细菌感染和空气污染对身体带来的不良影响。研究[13]表明，雾霾中包含有上千种微生物，其中绝大部分为非致病性的微生物，细菌至少占全部微生物的80%以上。本研究运用分子生物学技术鉴定郑州市冬季雾霾空气中28株细菌，其中芽孢杆菌属占85.7%，蛾微杆菌属、假单胞菌属、葡萄球菌属和志贺菌属均占3.5%。龚婵娟等[14]研究表明，在国内调查的城市中冬季共出现32属空气细菌，其中优势菌属为芽孢杆菌属、葡萄球菌属和微球菌属。在城市公共场所室外空气中，同样分离到芽孢杆菌属、葡萄球菌属为空气细菌的优势菌属，其中芽孢杆菌属较多[15]。这些报道与本研究结果基本一致，郑州市冬季雾霾中细菌多样，且不同地点空气细菌的优势菌属基本相同。

在调查的4个区域中，郑州大学第一附属医院雾霾空气中细菌种类较其他区域多样，检出芽孢杆菌属、蛾微杆菌属、葡萄球菌属和志贺菌属，其中葡萄球菌、志贺菌是临床上常见的致病性菌株，存在着空气传播感染的危险性。可能原因是，医院人口密度大、流动性强、车辆较多或通风性差、消毒灭菌力度不够、安全管理措施实施不到位等[16]。虽然其余时间各采样点空气细菌存在空气传播感染的危险性很小，但对能引起人类过敏原性反应的芽孢杆菌属也应该引起足够的重视。

药敏结果显示，郑州市冬季雾霾空气中细菌对过去常用的抗生素如复方新诺明、氨苄西林的耐药性达0%～7.1%，对现在常用的头孢三代抗生素如头孢哌酮、头孢曲松的耐药性也达7.1%～17.9%。这与全国细菌耐药监测报告[17]结果基本一致，考虑可能与临床较早较多使用这类抗生素有关。新型喹诺酮类环丙沙星、四十多年前被临床广泛使用而近年来使用却很少的氨基糖苷类庆大霉素对郑州市冬季雾霾空气中细菌敏感达100%。结果值得我们思考，是否较少抗生素的临床使用可以提高细菌的敏感性。

此次监测结果可以看出，郑州市冬季雾霾天气下不同区域空气细菌的种属分布与人群活动密切相关，加强医院附近雾霾空气中细菌的监测，郑州市雾霾空气细菌治理则达到事半功倍的效果。虽抗生素对临床患者有较好的抗菌消炎作用,但大剂量使用反而会破坏人体的正常防御系统，造成多方面的影响，如不良反应增多、抗生素耐药，甚至导致条件性致病菌在人体身上增加感染的风险[18]。合理使用抗生素对细菌感染防治意义重大,应该避免盲目性。