46,XY单纯型生殖腺发育不全患者的临床表型及遗传学研究

刘 荷，吴庆华，史惠蓉，孔祥东，赵振华

1)郑州大学第一附属医院妇科 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院遗传与产前诊断中心 郑州 450052

46,XY单纯型生殖腺发育不全(46,XY pure gonadal dysgenesis；46,XY PGD)于1955年由Swyer首次报道，也称Swyer综合征，是一种罕见的46,XY性发育异常疾病，可能由于胚胎期性别决定阶段基因调控异常导致。女性表型的患者携带46,XY核型，有女性外生殖器、正常或始基子宫、条索状性腺、多伴第二性征发育不良和原发性闭经。46,XY PGD患者的治疗重在及早切除未分化性腺和激素替代治疗。然而，在临床实践中，由于包括46,XY PGD 等的46,XY性发育异常患者的临床异质性和遗传异质性高，以及对该类疾病宣教较少，患者依从性差，临床诊治中易发生漏诊或失访。本研究对8例46,XY PGD患者的临床表型和诊治资料进行分析，并对在该病中起重要作用的性别决定基因(sex determining gene Y,SRY)进行测序分析，以进一步探讨46,XY PGD患者的临床诊治策略及遗传学病因。

1 对象与方法

1.1研究对象8例46,XY PGD病例均为2013年8月至2017年7月郑州大学第一附属医院收治的患者，其父母均非近亲婚配，否认家中有类似病史及遗传病史，患者母亲孕期无特殊用药史。对患者临床表现、体格检查、实验室检查、影像学检查、手术及随访情况进行回顾性分析研究。所有患者外周血均在本实验室保存并行SRY基因突变检测。

1.2身高检测和Tanner分期除1例2岁患儿未测身高，余患者均测量身高。Tanner分期[1]评价第二性征发育情况。

1.3影像学检查盆腔彩色多普勒超声是主要检查手段，以了解子宫及性腺发育情况、有无性腺肿瘤。

1.4G显带核型分析取0.5 mL肝素锂抗凝的外周血接种于5 mL PRMI 1640培养基中，37 ℃培养72 h，加入20 mg/L秋水仙素200 μL，3 h后常规染色体制片，G显带核型分析，每例计数30～100个细胞。

1.5SRY基因PCR及测序分析提取外周血基因组DNA，PCR扩增位于Y染色体短臂上SRY基因的整个开放阅读框架部分，运用Primer 5.0设计包含SRY基因外显子及其部分侧翼的扩增引物，引物1上游序列5’-AAGTTTCGAACTCTGGCACCTTTCA-3’，下游序列5’-GGCCTGTAATTTCTGTGCCTCCTGG-3’；引物2上游序列5’-GTCTCGCGATCAGAGGCGCA-3’，下游序列5’-GGAGCATCTAGGTAGGTCTTTGTAGCC-3’。PCR反应体系为25 μL：10 μmol/L上下游引物各1 μL，DNA样本50 ng。扩增条件为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，57～63 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环。PCR反应结束后，经15 g/L琼脂糖凝胶电泳，PCR产物纯化后，用ABI3130X基因测序仪进行双向测序，测序结果用Chromas软件与正常序列进行对比，寻找基因突变位点。

1.6血清性激素水平测定所有患者性激素水平均使用罗氏电化学自动发光仪进行检测，各项正常范围如下：卵泡刺激素(FSH，卵泡期3.5～12.5 IU/L)、黄体生成素(LH，卵泡期2.4～12.6 IU/L)、雌二醇(E2，卵泡期12.4～233.0 ng/L)、孕激素(P，卵泡期0.2～1.5 μg/L)及睾酮(T，女性0.084～0.481 μg/L)等。

1.7病理检查3名患者明确诊断后，即行性腺切除手术并送行病理学检查。

1.8随访要求幼儿患者每年复查，青春期后的患者每隔3个月来院复查。

2 结果

2.1 8例患者的临床资料及辅助检查结果见表1。所有患者选择抚养的社会性别均为女性，原发性闭经6例，生长发育迟缓3例，外阴发育异常1例。测量身高的7例患者中有3例身高低于正常同龄人，所有患者乳房及阴毛发育情况普遍落后于正常同龄人。

2.2盆腔超声检查子宫及性腺发育情况2例患者未见子宫，6例患者子宫体积小；7名患者盆腔未探及附件。除1例2岁的儿童未查性激素外，余患者均行性激素水平检测，FSH为(52.8±35.3)IU/L，LH为(17.6±14.0)IU/L，E2水平偏低，为(19.4±25.0)ng/L(<10 ng/L按5 ng/L计算，<5 ng/L按2.5 ng/L计算)，P为(0.5±0.3)μg/L，T为(0.2±0.1)μg/L。

2.3患者SRY基因检测结果、病理学结果及超声复查结果所有患者外周血染色体核型分析提示46,XY，SRY基因扩增均为阳性；DNA测序提示病例4携带SRY基因c.280C→G(p.Leu94Val)突变。对该患者父亲及妹妹进行SRY基因检测，其父亲携带SRY基因，但未检测到突变位点(图1)，其妹未检出SRY基因，提示该家族患者为新发突变。其他7例患者SRY基因扩增产物测序未见异常。

表1 8例患者初诊的临床资料及辅助检查结果

*：B表示乳房；P表示阴毛；均分1～5级

上排：病例4患者的SRY基因检测结果，箭头处可见患者存在SRY基因c.280C→G(p.Leu94Val)突变；下排：患者父亲未见该位点突变

图1SRY基因检测结果

所有患者一经诊断，均告知其发生性腺肿瘤的风险及建议腹腔镜探查并行性腺切除术，有3例患者行手术。病例2性腺切除后病理检查见左、右附件输卵管组织，另见少许卵巢样组织；病例6病理检查提示左侧性腺见输卵管样结构及纤维组织，右侧性腺见输卵管样及卵巢样组织；病例8双侧附件切除组织病理示为输卵管样组织，未见性腺组织。其余5名患者因超声未发现性腺，要求暂缓行性腺探查切除术。

患者就诊后给予戊酸雌二醇2 mg口服，3例患者子宫发育有明显改善。病例5于17岁初次就诊时子宫大小为33 mm×24 mm×12 mm，性腺切除术后10个月后复查子宫大小为49 mm×26 mm×24 mm，治疗22月后复查子宫大小为43 mm×34 mm×30 mm。病例6初次就诊时子宫大小为20 mm×10 mm×17 mm，口服戊酸雌二醇两月后复查超声，结果提示子宫大小为34 mm×33 mm×21 mm。病例7初次就诊时子宫大小为27 mm×21 mm×12 mm，7个月后复查显示子宫大小为31 mm×24 mm×10 mm。而携带有SRY基因突变的病例4行6个月的雌激素补充治疗，子宫大小无明显改变，患者及家属放弃治疗。病例3为9岁患儿，应用生长激素治疗，暂未行性激素治疗。病例1和2未按要求复查并失访。

3 讨论

本研究对8例46,XY PGD患者的临床表现和诊治进行了总结分析，对最常见的遗传相关基因SRY进行了检测，发现其中1例患者携带SRY基因c.280C→G(p.Leu94Val)突变。

46,XY PGD的发生率低，其诊断基于全面临床评价、详细的病史，特征性改变以及相关检查(包括染色体核型、性激素测定)等。在临床实践中，要与多种其他类型的46,XY性发育异常疾病相鉴别。携带45,X/46,XY嵌合体核型的特纳综合征患者的临床表型常与46，XY PGD相似，患者因有发育不良的性腺导致了子宫发育不良、第二性征发育落后和原发性闭经等，查外周血染色体有Y染色体存在，两类疾病的主要鉴别在于45,X/46,XY核型的患者多有身材矮小，而46,XY PGD患者可能由于Y染色体的作用或缺乏雌激素致骨骺闭合延迟，故绝大多数患者身高正常或高于平均女性身高[2-4]。然而，在本研究中有两例患者主要就诊原因为身高矮小，最初诊断考虑其为45,X/46,XY嵌合型特纳综合征，经行染色体检查，核型计数100个后确定为46,XY核型，临床诊断考虑46,XY PGD，故对于疑似性染色体异常导致的性腺发育不良患者，应对染色体核型计数至100个。46,XY PGD要与雄激素不敏感综合征相鉴别，后者临床变异广泛，包括从正常女性表型到外生殖器发育不良的男性，存在男性性腺、有较高的雄激素水平是雄激素不敏感综合征区别于46,XY PGD患者的主要特征。所有携带46,XY核型的17α羟化酶缺陷症患者的表型均为女性，身高正常或高于平均女性水平，可有发育不良的性腺、第二性征发育不良及原发闭经等，临床表现与46,XY PGD相似，17α羟化酶缺陷症患者血孕酮及血尿17羟孕酮增高、肾上腺皮质增生和高血压是与46,XY PGD鉴别的要点[5]。此外，46,XY PGD要和46,XX PGD相鉴别，故对于性发育不良患者，核型分析是最基本和重要的实验室检查。

部分46,XY性发育异常疾病如雄激素不敏感综合征和17α羟化酶缺陷症的致病基因已经明确，而对46,XY PGD的致病原因还不甚清楚。目前研究最明确的是SRY基因在性别决定中的作用，10%～15%的46,XY 性腺发育不良患者携带SRY基因突变[6]。本研究中的8例46,XY单纯型生殖腺发育不全患者行SRY基因PCR和测序，其中病例4携带一个新发的SRY基因c.280C→G(p.Leu94Val)突变，导致原来编码亮氨酸(Leu)的第94位密码子被缬氨酸(Val)代替，该突变型在既往国内外文献未见报道。Mitchell等[7]对46，XY PGD患者中发现的一个SRY基因的p.L94P突变行功能分析，提示第94位点处氨基酸的改变导致SRY基因HMG区第二个螺旋结构破坏，降低了DNA亲和力。故本研究中病例4患者携带的SRY基因c.280C→G(p.Leu94Val)突变可能导致SRY基因与DNA结合能力消失，从而导致46,XY PGD的发生。其余7例患者SRY扩增阳性而无突变，提示SRY基因虽是男性性别分化的启动基因，但并不是影响男性性别分化唯一的基因，影响性腺分化发育过程的其他基因如SOX9、NR5A1、WT1、NR0B1、WNT4等也可能参与46,XY单纯型生殖腺发育不全的发生。

及早对46,XY PGD患者明确诊断对于患者治疗和预后有三个重要意义：降低恶性肿瘤发病风险、诱导青春期发育及预防骨质疏松。46,XY PGD患者发生恶性肿瘤的风险在15%～35%，最常见的肿瘤是性腺母细胞瘤和无性细胞瘤，肿瘤发生的风险随年龄增长而增加，30岁时发生肿瘤的风险为50%～70%，40岁时发生风险高达80%[8]，一旦诊断，立即进行双侧性腺切除术。多数46,XY PGD患者性激素呈现高促性腺激素低性腺激素水平，如果46,XY女性患者仍有较正常的雌激素水平及乳腺发育，应警惕激素分泌型肿瘤存在的可能性[9]，其分泌的激素主要为雌激素，引起假性女性第二性征发育。

对于46,XY PGD患者的处理和其他原因导致的卵巢功能不全一样，包括应用雌激素进行青春期诱导，以及长期的雌孕激素联合应用[10]。雌激素补充治疗对于46,XY PGD女性患者的子宫发育有重要的作用。本研究中有2例患者因年龄较小，暂未给予激素补充治疗，3例患者给予激素治疗2月至22月，子宫均有明显的发育；而携带SRY基因突变的患者行激素治疗6个月后无明显效果而放弃激素补充治疗(尽管已告知激素治疗对于心血管疾病或骨质疏松疾病有重要的预防意义)。2例患者未遵医嘱定期复查。已有较多文献[11-14]报道46,XY PGD患者在子宫发育至正常大小时，可以通过赠卵试管婴儿技术成功妊娠分娩。Y染色体的存在不影响辅助生育技术中药物治疗或妊娠期激素对子宫内膜的效果。

从本研究和既往46,XY PGD相关文献可见，及早诊断和治疗对患者的预后尤为重要，作者在研究中发现，临床诊治中存在随访困难和患者依从性差等情况，与社会宣教和患者意识有关。在本病长期的诊治中，遗传咨询特别重要，要明确告知患者性腺肿瘤发生风险和性腺及早切除的必要性，与此同时，对于46,XY PGD患者的心理支持很重要，通过系统治疗和长期监测随访调整治疗方案，患者也可以有生育机会并拥有正常的生活[15-16]。