长链非编码RNA FOXD2-AS1对卵巢癌细胞增殖和迁移的影响

卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，严重影响女性健康［1］。探讨卵巢癌的发生、发展规律具有重要的意义。长链非编码RNA（lncRNA）是RNA聚合酶Ⅱ转录的产物，与肿瘤的发生、发展密切相关［2］。lncRNA在卵巢癌组织中异常表达，lncRNA可能参与卵巢癌的发生、发展［3］。FOXD2-AS1是一种新发现的lncRNA，在多种肿瘤中高表达，对调控肿瘤进展发挥重要的作用［4-5］。因FOXD2-AS1在卵巢癌中作用的相关报道较少，本研究旨在通过检测卵巢癌组织和细胞系中的FOXD2-AS1表达，通过下调卵巢癌HO-8910细胞中FOXD2-AS1的表达，探究FOXD2-AS1对HO-8910细胞增殖和迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 收集2017年2月至2017年9月华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院（武汉市妇幼保健院）手术切除的16例卵巢癌患者的组织标本，立即置于液氮保存，术后均经病理证实。该研究获得本院医学伦理委员会同意，所有患者均签署知情同意书。

1.1.2 细胞与试剂 人正常卵巢上皮细胞系IOSE80、人卵巢癌细胞系（OC3、HO-8910、A2780、SKOV-3）均购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所细胞库。RPMI 1640、DMEM、DMEM/F12培养液和胎牛血清（FBS）均购自美国Hyclone公司。小干扰RNA-FOXD2-AS1（siRNA-FOXD2-AS1正义链5'-GGCUUUUCCACUAGUUACUGA-3'，反义链 5'-AGU AACUAGUGGAAAAGCCCA-3'）和阴性对照RNA均购自上海吉玛公司。Lipofectamine 2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司。RNA逆转录试剂盒及荧光实时定量聚合酶链式反应（quantitative PCR，qPCR）试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司。CCK-8试剂盒购自上海东仁化学科技公司。Transwell小室购自美国康宁公司。抗葡萄糖调节蛋白94（glucose regulated protein94，GRP94）、β-catenin、cyclin D1、c-myc、β-tubulin抗体均购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染 IOSE80、A2780、SKOV-3细胞在DMEM/F12培养液中传代培养，OC3、HO-8910细胞在RPMI 1640培养液中传代培养，均含10%胎牛血清，置于37℃、5%CO2培养箱。每日更换新鲜培养液，当细胞汇合度达70%时传代培养。取对数生长期的卵巢癌HO-8910细胞接种于6孔细胞培养板中，当细胞汇合度达30%～40%时，严格按照Lipofectamine 2000试剂盒说明书进行转染操作，分别转染siRNA（实验组）和阴性对照RNA（对照组），24 h后更换新鲜培养液。

1.2.2 qPCR TRIzol法提取组织或细胞中总RNA，应用RNA逆转录试剂盒反转录获得cDNA，应用qPCR试剂盒进行qPCR，以2-ΔΔCt法进行定量处理，以GAPDH为内参检测FOXD2-AS1和GRP94 mRNA相对表达水平，以U6为内参检测miR-150-5p相对表达水平。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.3 CCK-8法 取两组对数生长期卵巢癌HO-8910细胞，培养液重悬调整细胞密度为1.5×105/mL，取20 μL/孔铺于96孔板，分别于接种培养第1、2、3、4、5天，加入13 μL/孔CCK-8试剂，继续培养4 h，吸去孔中培养液，加入100 μL二甲基亚砜，振荡溶解结晶。酶标仪检测490 nm波长的吸光度（A）值。

1.2.4 Transwell迁移实验 取两组对数生长期卵巢癌HO-8910细胞，无血清培养液重悬调整细胞密度为1.5×105/mL，取200 μL/孔加入Transwell培养板上室，将含血清的完全培养液以500 μL/孔加入Transwell培养板下室，培养箱培养24 h，取出Transwell培养板上室，甲醇固定，结晶紫溶液染色，棉签擦去未穿过底膜的HO-8910细胞，显微镜下随机选取5个视野计数后取平均数。实验重复4次。

1.2.5 生物信息学方法 应用starBase网站预测FOXD2-AS1可互补结合的微小RNA（microRNA，miRNA），在www.microRNA.org网站预测相应miRNA可互补结合的基因。

1.2.6 Western blot法检测 取两组对数生长期卵巢癌HO-8910细胞，裂解提取总蛋白，每组蛋白以30 μg上样量应用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，应用硝酸纤维素膜转膜，加入5%脱脂奶粉的封闭液封闭，加入一抗GRP94（1:1 000）、β-catenin（1:1 000）、cyclin D1（1:2 000）、c-myc（1:2 000）、β-tubulin（1:3 000），4℃过夜孵育，洗膜后加入二抗室温孵育，化学发光法发光显影，凝胶成像系统显影。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。实验数值以均数±标准差（）表示，组间均数比较采用t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 FOXD2-AS1在卵巢癌组织和细胞中的表达

本研究采用qPCR检测16例卵巢癌组织及正常癌旁组织中的FOXD2-AS1表达，结果发现FOXD2-AS1在卵巢癌组织相对表达量为8.56±0.51，明显高于正常癌旁组织的2.38±0.21，差异具有统计学意义（t=11.27，P＜0.01，图1）。进一步检测不同卵巢癌细胞中的FOXD2-AS1表达水平，结果发现与正常卵巢上皮细胞IOSE80相比，FOXD2-AS1在不同卵巢癌细胞系中的表达均明显增加（P＜0.05，图2）。

图1 FOXD2-AS1在卵巢癌组织和正常癌旁组织中的表达

图2 FOXD2-AS1在正常卵巢上皮细胞和卵巢癌细胞系中的表达

2.2 FOXD2-AS1在卵巢癌HO-8910细胞中的表达

采用qPCR检测显示，在实验组和对照组HO-8910细胞中的FOXD2-AS1相对表达量分别为0.29±0.06和1.01±0.07，差异具有统计学意义（P＜0.01），siRNA-FOXD2-AS1可有效降低HO-8910细胞中的FOXD2-AS1表达。

2.3 下调FOXD2-AS1表达对卵巢癌HO-8910细胞增殖活性的影响

采用CCK-8法检测显示，接种3天后，对照组HO-8910细胞吸光度明（A）值显高于实验组，提示下调FOXD2-AS1表达可抑制HO-8910细胞增殖活性（图3）。

2.4 下调FOXD2-AS1表达对卵巢癌HO-8910细胞迁移能力的影响

采用Transwell迁移实验检测发现，对照组穿膜细胞数为（143.40±12.36）个/视野，明显高于实验组的（62.44±10.87）个/视野，差异具有统计学意义（P＜0.01，图4），提示下调FOXD2-AS1表达可抑制HO-8910细胞的迁移能力。

图3 下调FOXD2-AS1表达对卵巢癌HO-8910细胞增殖活性的影响

图4 下调FOXD2-AS1表达对卵巢癌HO-8910细胞迁移能力的影响

2.5 生物信息学方法对FOXD2-AS1互补结合的miRNA及下游基因预测

采用starBase和microRNA.org网站预测分析显示，FOXD2-AS1互补结合miR-150-5p后可互补结合GRP94 mRNA，结合区域均为miR-150-5p的“AACCCUC”区域。

2.6 下调FOXD2-AS1对卵巢癌HO-8910细胞中miR-150-5p和GRP94 mRNA表达的影响

采用qPCR检测显示，对照组HO-8910细胞中miR-150-5p相对表达量1.01±0.08明显低于实验组的5.45±0.91，差异具有统计学意义（P＜0.01）；对照组HO-8910细胞中GRP94 mRNA相对表达量1.02±0.11明显高于实验组的0.32±0.05，差异具有统计学意义（P＜0.01）。提示下调FOXD2-AS1能够增加miR-150-5p表达，减少GRP94 mRNA表达。

2.7 下调FOXD2-AS1对卵巢癌HO-8910细胞中的GRP94和Wnt/β-catenin信号通路蛋白的表达

采用Western blot法检测发现，下调FOXD2-AS1表达后，GRP94蛋白表达降低，Wnt/β-catenin信号通路蛋白β-catenin、cyclin D1、c-myc表达降低（图5）。提示FOXD2-AS1可能通过影响GRP94和Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达调控细胞增殖和迁移。

图5 下调FOXD2-AS1对卵巢癌HO-8910细胞中GRP94和Wnt/βcatenin信号通路蛋白表达的影响

3 讨论

lncRNA是一类转录本长度＞200个核苷酸的RNA，由于其不具有编码蛋白的功能，起初被认为不具有生物学功能，是基因组转录的“噪音”［6］。近年来，大量lncRNA被发现在细胞周期中参与细胞增殖、迁移、凋亡等生物学过程，在多种肿瘤中均呈现异常表达，lncRNA在人类肿瘤发生、发展中起到重要作用［7］。lncRNA已成为继miRNA后非编码RNA研究领域的又一研究热点［8］。lncRNA在卵巢癌中的作用日益引起研究者的广泛关注。

Su等［5］研究发现，FOXD2-AS1在膀胱癌中表达上调，可促进肿瘤的进展，并与膀胱癌的复发密切相关。Bao等［4］研究发现，食管癌中FOXD2-AS1过表达与患者不良预后相关，可能是预测食管癌预后的生物标志物。Yang等［9］研究发现，FOXD2-AS1在结直肠癌中发挥癌基因的作用，促进肿瘤细胞的转移。而FOXD2-AS1在卵巢癌中的研究尚少有报道。本研究结果表明，与正常癌旁组织和正常卵巢上皮细胞相比，在卵巢癌组织和细胞系中FOXD2-AS1表达均显著增加，提示FOXD2-AS1基因可能在卵巢癌的发生发展中发挥癌基因的作用。为进一步研究FOXD2-AS1在卵巢癌中的生物学功能，本研究通过体外细胞实验发现，在卵巢癌HO-8910细胞中FOXD2-AS1表达被抑制后，HO-8910细胞增殖活性和迁移能力降低，说明FOXD2-AS1可能主要通过促进细胞增殖和迁移参与卵巢癌的发生发展。

miRNA是lncRNA发挥作用的重要环节，lncRNA可作为结合miRNA的“海绵”，下调miRNA的表达发挥作用［10］。应用starBase网站预测显示，FOXD2-AS1可互补结合miR-150-5p。Xia等［11］研究发现，miR-150-5p在卵巢癌组织中表达低于正常癌旁组织，下调miR-150-5p表达可促进卵巢癌细胞的增殖和转移，miR-150-5p在卵巢癌中发挥抑癌基因作用。本研究发现，抑制FOXD2-AS1表达后，miR-150-5p表达增加。miRNA主要通过在转录水平抑制基因的表达发挥作用［12］。应用www.microRNA.org网站预测显示，miR-150-5p可互补结合GRP94。本研究发现，miR-150-5p表达增加后，GRP94蛋白的表达降低。GRP94是一种高度保守的分子伴侣，在肝癌、乳腺癌、胃癌等多种肿瘤中呈高表达趋势，可通过活化Wnt/β-catenin等多种信号通路，促进肿瘤的发生发展［13-15］。沉默GRP94表达可有效抑制肿瘤的增殖和迁移能力。本研究发现，GRP94蛋白表达降低后，Wnt/β-catenin信号通路蛋白β-catenin、cyclin D1、cmyc蛋白表达降低，提示Wnt/β-catenin信号通路转导抑制导致卵巢癌细胞的增殖和迁移被抑制。

综上所述，FOXD2-AS1在卵巢癌组织及细胞系中表达增加，下调卵巢癌HO-8910细胞中FOXD2-AS1表达可抑制卵巢癌HO-8910细胞的增殖活性和迁移能力，其作用机制可能是FOXD2-AS1靶向干扰miR-150-5p表达，进而影响GRP94基因的表达，调控Wnt/β-catenin信号通路的转导。本研究为深入探索卵巢癌的发生、发展及治疗新靶点提供了新的方向。