A2aR在弥漫大B细胞淋巴瘤组织和CD8+T细胞上的表达和预后价值的研究*

张婷婷 王先火 孟斌 任秀宝 张会来

弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤中最常见的类型，在临床表现、免疫表型和分子遗传学等方面具有高度异质性［1］。腺苷信号通路是近年来被证实的一种新型免疫逃逸机制。肿瘤细胞在乏氧条件下释放核苷酸，核苷酸进一步由CD39/CD73水解为腺苷，游离腺苷与4个不同的G蛋白偶联受体（A1、A2A、A2B和A3）结合发挥广泛的免疫抑制作用，其中A2aR因其高亲和力和广泛表达而受到关注［2］。研究表明，阻断A2aR可增强肿瘤浸润淋巴细胞的活性，提高抗肿瘤免疫反应［3-4］。肿瘤源性的腺苷和抗肿瘤T细胞上A2aR表达参与多种肿瘤化疗及免疫治疗的耐药［5-6］。目前，仅有少数研究报道A2aR在实体瘤中的表达及意义［3，7］，尚未见血液肿瘤中A2aR表达和临床意义的研究。本研究旨在探索DLBCL中A2aR总表达和肿瘤浸润淋巴细胞中CD8+T细胞上A2aR表达与患者临床病理特征、预后之间的关系，为进一步研究DLBCL多重免疫逃逸机制和免疫治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病例资料

收集2010年1月1日至2015年12月31日就诊于天津医科大学肿瘤医院初治的72例DLBCL患者石蜡组织和临床病理资料。所有患者均接受2个周期及2个周期以上类RCHOP方案治疗。患者年龄为17～84岁，平均年龄为（52.5±14.2）岁；其中男性39例（54.2%），女性33例（45.8%）；生发中心B细胞（germinal center B cell，GCB）亚型31例（43.1%），非生发中心B细胞（nongerminal center B cell，non-GCB）亚型35例（48.6%），未分类6例（8.3%）。

1.2 方法

1.2.1 实验试剂 石蜡组织4 μm切片，采用多重免疫组织化学法检测DLBCL组织中A2aR、CD8的表达。兔抗人A2aR、CD8多克隆抗体购自英国Abcam公司；Opal多染试剂、HRP兔二抗、blocking buffer均购自美国Perkin Elmer公司。

1.2.2 实验原理 多重免疫组织化学技术是在原免疫组织化学基础上，采用二抗上带有的HRP催化加入体系的非活性荧光素，荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟临近目的蛋白上的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。然后微波处理，非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素还留存在样品上（荧光素不受微波处理影响，并能在抗体去除后保留信号），微波处理之后可进行下一个蛋白的染色。

1.2.3 实验步骤 取新鲜标本，10%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚度切片；将组织切片放置在70℃恒温箱中烘烤2 h，二甲苯、梯度乙醇浸片；将玻片浸泡于250 mL抗原修复液中，置于微波炉中（高火至液体沸腾，调至低火，维持15 min），室温自然冷却；滴加blocking buffer，保湿孵育10 min；滴加CD8抗体（稀释浓度1∶1 000），4℃冰箱过夜；滴加HRP兔二抗，保湿孵育10 min；滴加opal 520，保湿孵育10 min，TBST冲洗玻片；将玻片浸泡于250 mL抗原修复液中，置于微波炉中，重复上述步骤，滴加A2aR抗体（稀释浓度1∶3 500）、HRP兔二抗、opal 620；滴加DAPI、封片。

1.2.4 结果判读 采用Mantra成像系统进行图像采集，每张切片采集20个200倍视野。应用Inform软件进行蛋白定量、定位分析。A2aR阳性定义为≥1%的细胞出现细胞膜着色。

1.3 随访

通过查阅门诊、住院病历及电话进行随访，随访日期截至2017年4月。所有患者均获得随访，中位随访时间为35（4～83）个月。预后评价指标为OS，定义为确诊至患者死亡（完全数据）或末次随访的时间（截止数据）。

1.4 统计学分析

采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析。A2aR表达与DLBCL患者临床病理特征之间的关系采用χ2检验，预后分析采用Kaplan-Meier法及Log-rank检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 DLBCL组织及CD8+T细胞上A2aR表达

72例DLBCL患者中，A2aR总表达阳性率为41.7%（30/72），阴性率为58.3%（42/72），A2aR阳性和阴性表达的比较见图1。CD8+患者有58例，其中CD8+T细胞上A2aR表达阳性率为27.6%（16/58），CD8+T细胞上A2aR表达阴性率为72.4%（42/58），CD8+T细胞上A2aR的表达见图2。

2.2 A2aR总表达与患者临床病理特征之间的关系

χ2检验结果显示，A2aR总表达与患者分期、IPI评分、Ki-67、β2-MG、B症状相关（P＜0.05，表1）。

2.3 CD8+T细胞上A2aR表达与患者临床病理特征之间的关系

χ2检验结果显示，CD8+T细胞上A2aR表达与患者分期、结外受累数目、IPI评分、Ki-67、β2-MG、B症状、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）相关（P＜0.05，表2）。

2.4 A2aR总表达与患者预后的关系

Kaplan-Meier生存曲线分析显示，A2aR阳性组患者OS较阴性组较差（P＜0.05，图3）。A2aR阳性组患者中位OS（median OS，mOS）为53.5（95%CI：41.4～65.5）个月，而A2aR阴性组患者mOS为69.0（95%CI：60.9～77.1）个月。随访期间，A2aR阴性组8例（19.0%）死亡，A2aR阳性组13例（43.3%）死亡。

图1 A2aR染色结果（×200）

图2 CD8+T细胞上A2aR的表达

2.5 CD8+T细胞上A2aR表达与患者预后的关系

Kaplan-Meier生存曲线分析显示，CD8+T细胞上A2aR阳性组患者OS较阴性组显著更差（P＜0.001），且生存曲线比定位A2aR总表达患者生存曲线分离更加明显（图4）。A2aR阳性组患者mOS为34.8（95%CI：22.2～47.5）个月，而A2aR阴性组患者mOS为76.2（95%CI：69.8～82.5）个月。随访期间，A2aR阴性组中4例（9.5%）死亡，A2aR阳性组中11例（68.8%）死亡。

表1 A2aR总表达与患者临床病理特征之间的关系

表1 A2aR总表达与患者临床病理特征之间的关系 （续表1）

表2 CD8+T细胞上A2AR表达与患者临床病理特征之间的关系

图3 A2aR总表达与患者总生存期之间的关系

图4 CD8+T细胞上A2AR表达与患者总生存期之间的关系

3 讨论

A2aR属于新型第二代免疫检查点分子，是肿瘤微环境CD8+T细胞表面主要的免疫检查点受体之一，可抑制T细胞上TCR诱导的NF-κB信号通路，抑制IL-2、IL-4、IFN-γ分泌，从而诱导效应T细胞功能失活［5］。A2aR上调T细胞表面其他免疫检查点，如PD-1、LAG-3等［8］表达，共同介导肿瘤免疫逃逸。此外，A2aR在肿瘤微环境其他免疫细胞，如NK细胞、巨噬细胞等均有表达，通过多种途径发挥协同免疫抑制作用［2］。目前，关于A2aR蛋白在肿瘤中的表达及临床意义研究较少。Ma等［3］研究发现，在头颈鳞状细胞癌中A2aR表达与患者病理分级、肿瘤大小和淋巴结转移相关，表明A2aR表达水平与头颈鳞状细胞癌恶性程度密切相关。在非小细胞肺癌中，A2aR表达与患者性别、吸烟、病理分类相关，A2aR表达越高，患者预后越好，目前尚无解释［7］。A2aR在不同肿瘤中表达及预后价值并不相同。本研究分析了A2aR在DLBCL中表达情况和临床病理特征之间的关系。A2aR总表达与患者分期、IPI评分、Ki-67、β2-MG相关；A2aR+组患者OS较A2aR-组患者差，表明A2aR可能是DLBCL患者不良预后因素之一。CD8+T细胞作为肿瘤浸润淋巴细胞中效应毒性T细胞，对肿瘤细胞具有直接杀伤作用［9］。T细胞表面多重免疫检查点的表达可通过不同信号通路抑制T细胞活性，进而抑制机体的抗肿瘤免疫反应［10］。本研究分析了CD8+T细胞上A2aR表达与患者临床病理特征及预后的关系。A2aR+CD8+与患者分期、IPI评分、β2-MG、Ki-67、LDH、结外受累数目、B症状相关，A2aR+CD8+组患者OS较A2aR-CD8+组患者更差。相比A2aR总表达，定位CD8+T细胞上A2aR表达可更好地评价DLBCL患者的预后。

综上所述，A2aR的免疫治疗已显示出潜在的临床应用价值。A2aR抗体（PBF-509）联合PD-1抗体治疗非小细胞肺癌的临床Ⅰ/Ⅰb期试验（NCT02403193）正在开展。此外，动物实验表明，联合A2aR抗体可以降低免疫相关不良反应的发生频率［2］。A2aR有可能成为DLBCL淋巴瘤中新的免疫治疗靶点，并有望联合其他免疫检查点抗体应用于临床，从而进一步提高患者的疗效。