幽门螺杆菌感染与胃癌中PRC2和H3K27me3的表达关系*

张宁 曾智 阎丽萍 杨珂 孙庆文 黄鹏

胃癌是中国常见的恶性肿瘤之一，发病和死亡人数约占世界的50%［1］，其发病机制复杂，涉及多基因和多因素的共同作用，其中幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，HP）感染与胃癌发生存在密切的关系，但其作用机理目前尚不明确。多梳抑制复合物2（polycomb repressive complex 2，PRC2）是一组转录抑制因子，其核心成分果蝇zeste基因增强子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）具有组蛋白甲基转移酶活性，通过对组蛋白H3进行甲基化修饰，从而导致肿瘤的发生发展。目前，有关HP感染是否影响表观调控因子PRC2的表达尚缺乏报道。本研究采用免疫组织化学法检测胃癌组织中PRC2家族蛋白和组蛋白H3K27me3的表达情况，分析HP感染与上述蛋白表达的相关性，探索HP感染在胃癌发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 选取复旦大学附属上海市第五人民医院2014年1月至2017年10月行胃癌手术的84例患者，其中男性55例，女性29例，平均年龄53岁。所有患者术前未经任何抗肿瘤治疗且术后均得到明确的病理诊断。本研究通过医院伦理委员会审查［批号：（2017）伦审（060备）］，所有患者签署知情同意书。

1.1.2 主要试剂 HP快速尿素酶法检测试剂盒购于山东博迈达生物科技有限公司；DNA提取和PCR试剂盒购自天根生化科技公司；免疫组织化学试剂盒购自福州迈新公司；EZH2抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，SUZ12、EED和H3K27me3抗体购自英国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 取手术切除的胃癌组织并在距癌灶5 cm处取癌旁组织。胃癌标本分成3份，1份经10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，制片，用于HP染色和免疫组织化学检测；1份用于快速尿素酶检测；1份置于-80℃冰箱保存用于PCR检测。

1.2.2 HP快速尿素酶检测 新鲜胃黏膜（1 mm3）取样后立即置于加有底物反应液的试管内，充分震荡，室温静置5 min，观察试管内液体颜色。如果呈黄色，为阴性；如果呈浅红色～玫瑰红色，为阳性。

1.2.3 HP染色 采用改良的Giemsa染色法检测HP。石蜡切片脱蜡至水，置于0.5%盐酸酒精中10 min，充分水洗后将切片置于Giemsa工作液中经微波炉加热2～4 min。然后用1%冰醋酸快速浸洗，水洗，脱水，透明，封片。

1.2.4 PCR检测 1）组织DNA提取：将冻存的胃组织剪碎、匀浆，加入20 μL蛋白酶K（20 mg/mL），55℃水浴1 h完全消化后按照试剂盒说明书操作，提取DNA进行纯度测定；2）引物设计：针对VacA基因设计引物如下：F'：5-GGAGCCCCAGGAAACATTG-3'，R：5'-CTGCTTG AATGCGCCAAAC-3'。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；3）PCR反应条件：反应总体积为50 μL，上、下游引物各2 μL，应用Touchdown PCR方法扩增基因，94℃预变性4 min，94℃变性0.5 min，自65℃～50℃每降3℃循环3次，最后1个温度循环15次，所有循环结束后，72℃延伸10 min。

1.2.5 免疫组织化学法检测 石蜡切片脱蜡至水，微波修复抗原10 min，PBS洗涤，3%过氧化氢孵育20 min。山羊血清37℃封闭30 min，洗涤，分别滴加兔抗人EZH2抗体（1:200）、SUZ12抗体（1:100）、EED抗体（1:200）和鼠抗人H3K27me3抗体（1:100），4℃过夜。PBS洗涤后，分别滴加羊抗兔和兔抗鼠二抗工作液，温箱中孵育30min。滴加辣根过氧化物酶标记链酶卵白素，孵育30 min，DAB显色，终止反应。结肠癌和乳腺癌组织（由上海健康医学院基础医学院病理教研室收集与提供）用作阳性对照，阴性对照用PBS替代一抗。

1.2.6 免疫组织化学结果判读 随机选取5个高倍镜视野（×400），计数肿瘤细胞总数和阳性细胞数，计算阳性细胞百分比，以≤25%为0分，26%～50%为1分，51%～75%为2分，＞75%为3分；对染色强度进行计分，无显色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将上述两项得分相加，≥3分定义为阳性，＜3分定义为阴性。所有切片均由两名病理医生独立阅片和判读。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计数资料以百分率（%）表示，PRC2家族和H3K27me3蛋白的表达，以及与HP感染和临床病理资料之间的关系采用χ2检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HP检测结果

84例胃癌患者，HP快速尿素酶检测法检出率为70.24%（59/84）。Giemsa染色显示胃黏膜细胞胞质呈粉红色，胞核呈蓝色或紫色，HP呈淡蓝色或蓝色，弯曲状或弧形（图1A），HP检出率为61.90%（52/84）。电泳结果显示，VacA基因扩增电泳条带分子量为353 bp（图1B），PCR检测阳性率为76.19%（64/84）。3种检测方法中任一结果为阳性者均判为阳性。

2.2 PRC2家族和H3K27me3蛋白在胃癌组织中的表达

PRC2家族中3个成员EZH2、SUZ12和EED以及H3K27me3蛋白在胃癌组织中的表达均定位于细胞核，为棕黄色颗粒（图2A～D）。EZH2、SUZ12、EED和H3K27me3蛋白在胃癌组织的阳性表达率分别为79.76%（67/84）、77.38%（65/84）、40.48%（34/84）和69.05%（58/84），均显著高于癌旁组织（22.60%、34.52%、8.33%和14.29%），差异具有统计学意义（P＜0.05，表1）。

2.3 EZH2和H3K27me3蛋白表达与胃癌临床病理特征的关系

本研究分析了EZH2和H3K27me3蛋白表达与胃癌临床病理指标的关系，发现EZH2和H3K27me3的表达与淋巴结转移相关，发生淋巴结转移的病例EZH2和H3K27me3蛋白表达均显著高于无淋巴结转移的病例（P＜0.05，表2），与胃癌患者性别、年龄、肿瘤大小、浸润深度、Lauren分型、分化程度、TNM分期和生存时间均无显著相关性。

2.4 胃癌组织中PRC2和H3K27me3蛋白表达与HP感染的关系

在HP阳性胃癌组织中，EZH2、SUZ12、EED和H3K27me3蛋白的阳性表达率分别为89.06%（57/64）、84.38%（54/64）、46.88%（30/64）和82.81%（53/64），均显著高于HP阴性胃癌组织（50.00%、55.00%、20.00%和25.00%，P＜0.05）。差异具有统计学意义（P＜0.05，表3）。

2.5 胃癌组织中EZH2与H3K27me3蛋白表达的关系

胃癌组织中，67例EZH2表达阳性的病例中H3K27me3蛋白阳性表达率为74.63%（50/67），17例EZH2表达阴性的病例中H3K27me3蛋白阳性表达率为47.06%（8/17），前者显著高于后者，差异具有统计学意义（P＜0.05），EZH2与H3K27me3蛋白的表达呈正相关（表4）。

图1 HP检测结果

图2 PRC2家族蛋白和H3K27me3在胃癌组织中的表达（SP法×40）

表1 PRC2家族蛋白在胃癌组织及癌旁组织中的表达

表2 EZH2和H3H27me3蛋白表达与胃癌临床病理特征的关系

表2 EZH2和H3H27me3蛋白表达与胃癌临床病理特征的关系（续表2）

表3 PRC2和H3K27me3蛋白在HP阳性及阴性胃癌组织中的表达

表4 胃癌组织中EZH2和H3K27me3蛋白表达的关系

3 讨论

近年来，中国胃癌的发病率不断升高，在胃癌高发地区，成人HP感染率超过56%［2］。HP致癌机制与尿素酶造成的胃黏膜屏障损伤、空泡细胞毒素（VacA）和细胞毒素相关蛋白（CagA）引起的基因突变和免疫反应有关。有研究发现，HP感染可显著提高水通道蛋白（Aquaporin 3）和缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）表达，使人胃癌细胞AGS和GES-1活性氧含量增加，加重胃黏膜上皮细胞损伤［3］；还可以调节环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）和15羟基前列腺素脱氢酶（15 hydroxy prostaglandin dehydrogenase，15PGDH）表达进而使前列腺素E2水平上升［4］；此外，还可通过转录因子NF-κB上调miR-223-3p表达，进而抑制其下游靶基因ARID1A表达，促进胃癌细胞增殖和转移［5］。MABK通路中EGFR、RAF和MERK等分子在HP感染时表达上调，进而引发高胃泌素血症［6］。HP感染还可通过miR-181b激活IL-6/STAT3信号途径，进而抑制尾型同源盒转录因子（caudal type homeobox transcription factor 2，CDX2）表达和p53信号通路，导致胃癌预后不良［7］。目前，有关HP致癌机制的研究虽然取得了一定进展，但仍未完全阐述清楚，特别是HP感染是否影响表观调控因子的表达。本研究通过分析HP感染与胃癌组织PRC2家族蛋白和组蛋白H3K27me3表达的相关性，寻找其可能的致癌机制。

PRC2是一组转录抑制因子，核心成分EZH2基因位于7q35，其编码产物能对组蛋白进行甲基化修饰，维持下游靶基因沉默，从而诱导肿瘤的发生发展。多项研究表明，EZH2在恶性肿瘤中表达上调，并与肿瘤的侵袭和转移相关，是预后不良的指标［8-13］。本研究结果显示，EZH2蛋白在胃癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁组织，且与淋巴转移相关，这与既往文献报道相一致［12-13］。Chen等［14］研究表明，EZH2在胃癌组织中高表达，且与肿瘤的大小、浸润深度、转移及临床分期有关，本研究发现上述因素与胃癌组织中EZH2的表达均无显著相关性。Mattioli等［15］研究发现，EZH2表达水平与肿瘤类型有关，在肠型胃癌中的表达明显高于弥漫型胃癌。本研究结果显示，EZH2的表达水平与胃癌Lauren分型无关。EZH2单独存在时不具有组蛋白甲基转移酶活性，需要在PRC2家族另外两个成员SUZ12和EED的共同参与下构成复合物，才能发挥酶活性。由此可见，SUZ12和EED对于维持复合物结构的稳定性和EZH2的酶活性是必需的［16-18］。有研究报道，SUZ12在结直肠癌、肝癌和乳腺癌中表达均上调［19-20］。本研究对SUZ12和EED蛋白的表达进行分析，结果表明胃癌组织中SUZ12和EED蛋白的表达率显著高于癌旁组织。

组蛋白是染色质的基本组成单位，尾部某些氨基酸残基发生修饰后可以改变染色质的结构，从而影响基因的表达。组蛋白H3的N末端赖氨酸残基K27（H3K27）是最常见的甲基化修饰位点，三甲基化修饰后的组蛋白H3K27me3能抑制下游靶基因的转录，从而调控基因的表达。有关H3K27me3蛋白在肿瘤中的表达水平和临床意义的报道不尽相同，在肝细胞癌和膀胱癌中表达上调且预后不良［21-22］，而在乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌中表达均下调，且与预后不良相关［23］。作为EZH2的甲基化修饰对象，本研究对H3K27me3蛋白的表达进行分析，结果显示该蛋白在胃癌组织中的表达显著高于癌旁组织，且与淋巴结转移相关。

本研究对胃癌组织中PRC2家族蛋白表达与HP感染的相关性进行分析，结果显示该家族蛋白在HP阳性胃癌组织中的表达显著高于HP阴性胃癌组织，提示HP感染不仅与PRC2家族核心成员EZH2表达上调呈正相关，还与该家族中另外两个成员SUZ12和EED表达上调也相关。进一步分析HP感染与胃癌组织中H3K27me3蛋白表达的关系发现，H3K27me3在HP阳性胃癌组织中的表达显著高于HP阴性胃癌组织，且与EZH2蛋白表达呈正相关，提示HP感染与H3k27me3蛋白的表达相关。

综上所述，HP感染与胃癌组织中PRC2和H3K27me3蛋白表达上调相关，这为阐述病原体对宿主转录调控的影响提供了新的证据，也为探索HP致癌机制提供了新思路。但HP是否直接影响胃癌细胞中PRC2的表达，尚需进一步研究证实。