抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸和维生素E在人肺癌细胞生长中的作用

李 工 薛晓光 郑剑霄 邱圣红

(广东省中医院大学城医院放疗科，广东 广州 510006)

研究显示，抗氧化剂有助于癌症的预防〔1，2〕。生物通过有氧代谢而生存，有氧代谢产生活性氧(ROS)，正常情况下，人体内的过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等抗氧化剂会快速清除ROS，然而一旦生物体内的抗氧化系统无法承载氧化应激负荷时，ROS便会攻击DNA，造成DNA断裂、碱基错配、DNA蛋白质交联等多种DNA损伤〔3,4〕。受损的DNA在复制和分裂时可形成突变，进而激活癌基因、抑癌基因失活，造成细胞生长周期紊乱。氧自由基对DNA造成的损伤与肿瘤发生、发展密切相关〔5〕。抗氧化剂能提供电子，从而中和ROS或者其他可以引起DNA损伤并促进肿瘤发生的自由基。在肺癌细胞中基因突变可活化细胞内源的抗氧化体系，使细胞ROS降低从而促进细胞生长〔6〕。本研究旨在探讨抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)和维生素(Vitamin)E在人肺癌细胞生长中的作用。

1试剂与方法

1.1主要试剂 NAC，Vitamin E(Sigma，美国)，蛋白提取试剂盒(美国，Thermo Scientific)，RPMI1640培养液，血清(美国，gibco)p53抗体、p-p53抗体、γ-H2AM抗体和Actin抗体(Abcam，美国)，3，3-二氨基联苯胺(DAB)试剂盒，二氯荧光素双酶酸盐(DCFH-DA)探针(中国，碧云天)，5-溴脱氧尿苷嘧啶(BrdU)细胞增殖检测试剂盒(艾美捷，美国)。

1.2细胞培养 人肺腺癌细胞NCI-H1395由本实验室冻存保存，培养于10%胎牛血清+1%抗生素的RPMI1640培养液中，在5% CO2，相对湿度95%，37°C培养箱中培养。

1.3实验方法

1.3.1CCK-8检测肺腺癌细胞增殖情况 人肺腺癌细胞NCI-H1395胰酶消化，制成细胞悬液后按103的细胞密度接种于96孔版中，待细胞长到60%左右开始换入无10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养液培养，使细胞饥饿24 h后，分别加入1 mmol/L NAC(NAC组)，0.1 g/L和0.5 g/L Vitamin E(Vitamin E低剂量组和Vitamin E高剂量组)，同时设空白对照组(对照组)；2 μl shSCR(hsSCR组),2 μl shTP53(shTP53组)，2 μl shSCR+1 mmol/L NAC(shSCR+NAC组),2 μl shTP53+1 mmol/L NAC(shTP53+NAC组)，每孔加完药后放入无FBS的RPMI1640培养液中，放入培养箱中培养12 h，用CCK-8试剂盒进行检测。

1.3.2BrdU掺入检测肺腺瘤细胞增殖情况 人肺腺癌细胞NCI-H1395饥饿24 h后，分别加入1 mmol/L NAC,0.5 g/L Vitamin E无FBS的RPMI1640培养液，放入培养箱中培养12 h，胰酶消化离心10 min，每管中加入500 μl洗涤液重悬细胞，10 min离心洗涤2次，调整细胞数在105/管。向1.5 EP管中加入500 μl固定液重悬细胞，4℃过夜，然后向1.5 EP管中加入500 μl洗涤液离心10 min洗涤2次。1.5 EP管中加入500 μl通透液重悬细胞，冰上孵育2 min，然后向1.5 EP管中加入500 μl洗涤液离心10 min洗涤2次。加入300 μl DNA变性工作液重悬细胞，37℃反应30 min，然后再加入洗涤液离心10 min洗涤2次。以195 μl染色缓冲液重悬细胞后加入5 μl(0.125 μg)FITC-BrdU抗体，4℃避光孵育30 min。荧光显微镜下(日本OLYMPUS公司)观察。

1.3.3荧光显微镜检测肺腺癌细胞ROS水平 人肺腺癌细胞NCI-H1395消化计数后在24孔板中接种5×104个细胞每孔，贴壁培养24 h。分别加入1 mmol/L NAC(NAC组)和0.5 g/L Vitamin E(Vitamin E组)培养12 h，同时设空白对照组。弃去培养液，用PBS清洗细胞2次。用无血清RPMI1640培养液按照1∶1 000稀释DCFH-DA探针，终浓度为10 μl/L，每孔加入500 μl稀释后的探针，培养箱中孵育20 min。用无血清RPMI1640洗涤细胞3次，充分洗去未进入细胞的DCFH-DA探针，荧光显微镜下定性检测细胞ROS相对荧光强度。

1.3.4免疫组化检测肺腺癌细胞DNA损伤 人肺腺癌细胞NCI-H1395，饥饿24 h后，分别加入终浓度1 mmol/L NAC，0.5 g/L Vitamin E无FBS的RPMI1640培养液，培养箱中培养12 h，制备肺腺癌细胞NCI-H1395细胞切片，干燥处理后置于二甲苯(Ⅰ)(Ⅱ)中进行脱蜡处理，梯度酒精水化处理。置于3%的H2O2溶液中，在室温下孵育10 min，PBS洗涤，重复3次。将片子放入柠檬酸缓冲液(0.01 mol/L，pH6.0)中，进行抗原热修复。滴加山羊血清封闭液，37℃孵育30 min。加入稀释好的8-羟基鸟嘌呤抗体(1∶1 000)，4℃过夜处理，置于烤箱中复温30 min，温度设为37℃，PBST冲洗，重复3次。滴加生物素抗兔二抗，在37℃的环境下孵育1 min，PBST洗涤，重复3次。DAB显色，显色终止后对切片进行清洗。滴加苏木素，在室温下反应3 min，清水冲洗，盐酸酒精分化1 s，氨水返蓝5 min。梯度酒精脱水处理，二甲苯(Ⅰ)(Ⅱ)中透明，晾干，中性树胶封片。以PBS液为阴性对照，在显微镜(CK30-F200，日本Olympus公司)下对各切片的着色情况进行观察计算8-羟基鸟嘌呤阳性表达率。

1.3.5Western印迹 人肺腺癌细胞NCI-H1395消化计数后在6孔板中接种5×105个细胞每孔，贴壁培养24 h。分别加入1 mmol/L NAC(NAC组)和0.5 g/L Vitamin E(Vitamin E组)培养24 h，同时设空白对照组，蛋白提取试剂盒提取细胞蛋白，用BCA法测定每组蛋白质浓度，每孔总蛋白上样量为50 μg，上样后进行12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝脉电泳(SDS-PAGE)分离后转膜(80 V，90 min)，5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST洗膜5 min/3次。分别用如下一抗p53(1∶500)、p-p53(1∶500)、γ-H2AM(1∶5 000)和Actin(1∶1 000)4℃过夜，TBST洗膜5 min/次，洗5次。分别用稀释比例为1∶1 000的对应二抗37℃摇床反应1 h，TBST洗膜5 min/5次。用电化学发光(ECL)试剂盒进行显色后凝胶成像分析系统拍照(中国，Tanon)，采用LabWorks4.6软件进行灰度值分析。

1.4统计学分析 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组肺腺癌细胞NCI-H1395增殖情况比较 NAC组〔(22.8±0.4)%〕细胞生长经显著高于对照组〔(8.7±0.2)%〕(P<0.05)。与对照组相比，Vitamin E低剂量组、高剂量组促进细胞增殖，但Vitamin E低剂量组细胞生长率〔(13.1±0.3)%〕与对照组差异无统计学意义(P>0.05)，Vitamin E高剂量组〔(20.3±0.4)%〕与对照组比较增加了133.3%(P<0.05)。shSCR组、shTP53组、shSCR+NAC组、shTP53+NAC组细胞存活率分别为(7.27±0.08)%、(12.5±2.13)%、(13.62±2.41)%、(14.31±1.54)%。与shSCR组相比，shTP53组和shTP53+NAC组细胞存活率显著增加(P<0.05)，而与shTP53组相比，shTP53+NAC组细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05)，抑制p53后NAC并未促进细胞增殖。

2.2各组肺腺癌细胞NCI-H1395增殖情况比较 与对照组相比，NAC组和Vitamin E组肺腺癌细胞NCI-H1395荧光强度增加，NAC组和Vitamin E组Brdu 阳性细胞占总细胞的百分比〔(2.6±0.2)%、(2.7±0.2)%〕显著高于对照组〔(1.8±0.1)%〕，增加了44.5%、46.1%(均P<0.05)。

2.3各组肺腺癌细胞NCI-H1395 ROS生成情况比较 与对照组(15.3±0.4)相比，NAC组(9.2±0.2)和Vitamin E组(9.6±0.2)ROS分别降低了40.1%和37.2%，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

2.4各组肺腺癌细胞NCI-H1395 DNA损伤比较 与对照组〔(26.7±0.8)%〕相比，NAC组和Vitamin E组8-羟基鸟嘌呤阳性表达率〔(21.3±0.6)%、(20.6±0.5)%〕分别降低了20.4%和22.8%，差异均有统计学意义(均P<0.05)。如图1。

2.5各组p53、p-p53和γ-H2AM蛋白水平比较 与对照组相比，NAC组和Vitamin E组p53、p-p53和γ-H2AM蛋白水平均显著降低(P<0.05)，基本降低到零表达。如图2、表1。

图1 免疫组化检测肺腺癌细胞NCI-H1395 DNA损伤(×400)

图2 Western印迹检测肺腺癌细胞NCI-H1395中p53和γ-H2AM蛋白磷酸化水平

组别p53p-p53γ-H2AM对照组0.82±0.050.89±0.060.40±0.03NAC组0.00±0.001)0.00±0.001)0.00±0.001)Vitamin E组0.12±0.021)0.00±0.001)0.00±0.001)

与对照组相比:1)P<0.05

3 讨 论

NAC可促进谷胱甘肽(GSH)合成，同时还可以通过其还原性硫基捕获未成对的电子起到抗氧化作用〔7,8〕。Vitamin E可清除体内自由基，防止不饱和脂肪酸过度氧化，减少脂质过氧化物水平〔9,10〕。有研究指出〔11〕，抗氧化剂可在某些特定的情况下促进肿瘤的发展。Xu等〔12〕研究表明原癌基因刺激转录因子NF-E2相关因子2所介导的内源抗氧化剂的表达，从而减少ROS，并且促进肿瘤细胞增殖，与本研究结果一致。抗氧化剂可以减少内源性ROS防御体系中的基因表达，这与ROS数量降低，DNA损伤程度下降，并且GSH/氧化型(GSSG)的值增加相关〔13〕。说明加入NAC或Vitamin E后，能降低肺腺癌细胞NCI-H1395中的ROS水平，肺腺癌细胞中内源性的ROS防御体系被下调。

本研究结果提示p-53磷酸化水平的下降可能是抗氧化剂所诱导的肺腺癌细胞NCI-H1395增殖的作用机制之一。同时笔者推测抗氧化剂NAC引起p53表达下降的一个可能原因是抗氧化剂可以降低DNA氧化损伤，γ-H2AM的磷酸化，从而抑制p53的活化。但这种解释还需要进一步明确。由于肿瘤细胞模型的限制，只能研究抗氧化剂对于肿瘤细胞发展的影响，而不能进行抗氧化剂对于肿瘤细胞发生过程影响的研究。在之前的研究中，抗氧化剂对于化学方法引起的肺癌具有保护作用，同时，高剂量的ROS也可能与肿瘤的发展密切相关〔14〕。然而大量实验和临床数据表明，大豆异黄酮、胡萝卜素、Vitamin和NAC等抗氧化剂并不适合作为预防肺癌的药物，并且大量的使用这些抗氧化剂可能会增加机体患癌概率〔15,16〕。由于抗氧化剂的作用依赖于p53，所以在人体中TP53的突变发生在肿瘤发展的晚期过程，而抗氧化剂主要加快了癌症发展的早期过程。这表明，处于肺癌早期的患者服用抗氧化剂是非常危险的，这也许也是经常吸烟的人更容易患有慢性阻塞性肺疾病的原因之一，因为人在吸烟的过程中会摄入大量的NAC。

本研究表明抗氧化剂NAC和Vitamin E可通过降低肺腺癌细胞NCI-H1395中ROS引起的DNA损伤，从而降低p53的磷酸化水平，进而促进肺腺癌细胞NCI-H1395的增殖，为肺癌患者服用抗氧化剂的危害提供了理论支持，但此次研究仅在细胞层次上进行了讨论，此后还需更多的临床数据予以确认。