高迁移率族蛋白B1、Toll样受体4在脓毒症大鼠心肌组织中表达及意义

王 敬 陈冠男 吕 琪 肖培欣 孙淑丽 樊毫军 丁 辉 刘子泉 侯世科

(锦州医科大学武警后勤学院附属医院研究生培养基地，天津 300162)

脓毒症是机体出现感染后的全身性反应，严重者可诱发全身炎症反应综合征。研究〔1〕发现有高度可疑感染灶或细菌存在，病情可发展为急性器官衰竭，诱发严重脓毒症，严重患者还可出现体液复苏不可逆转的低血压进入脓毒性休克阶段，但相关发病机制尚不明晰。高迁移率族蛋白(HMG)B1广泛分布于高等真核生物细胞核中，是一类高度保守的蛋白质。HMGB1是脓毒症晚期炎性反应因子，其作为一种重要的致炎细胞因子和炎性反应介质，其与脓毒症性心肌损害的相关性的研究资料较缺乏〔2〕。Toll样受体(TLR)4归属于TLRs家族，其与脓毒症及心血管疾病方面已有部分探索性研究〔3〕。本研究探讨HMGB1、TLR4在脓毒症大鼠心肌组织中表达及意义。

1 材料与方法

1.1实验动物 选取清洁级SD大鼠50只，雌雄各半，体重250～300 g，适应性饲养1 w后开始实验，术前禁食12 h，自由饮水，随机分为5组，正常对照组、假手术组和模型组，其中模型组再分为模型12、24、48 h组，每组10只。

1.2脓毒症大鼠模型制备 采用盲肠结扎穿孔术制备脓毒症大鼠模型，大鼠禁水、禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥麻醉后固定，常规消毒铺巾后腹部正中切口，暴露并游离盲肠，模型组：4号线距盲肠末端结肠，18号针头盲肠游离末端穿孔，放回盲肠复位，关腹缝合。假手术组：不穿孔、不结扎盲肠，放回盲肠复位，关腹缝合。模型组分别于造模结束后24 h内采集标本后处死〔4〕。

1.3标本采集及保存 各组水合氯醛麻醉后腹主动脉取血2 ml后3 000 r/min 10 min离心取上清后-80℃条件下保存待检；打开大鼠胸腔分离心脏后将右心部分心肌组织10%甲醛固定。

1.4酶联免疫吸附试验(ELISA) 心肌组织匀浆后，3 000 r/min 10 min离心，取上清后-80℃条件下保存待检，酶联免疫吸附检测TLR4表达，试剂盒购于南京建成生物研究所，操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.5免疫组化染色 免疫组化染色检测心肌组织HMGB1表达，SP法对心肌组织进行免疫组化染色，心肌组织常规石蜡切片，脱蜡水化后，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，抗原修复后PBS冲洗3次，滴加山羊血清室温孵育20 min，PBS冲洗3次，滴加SP后室温孵育30 min，PBS冲洗3次后二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染〔5〕。

1.6病理组织学观察 取10%甲醛固定后的右心室心肌组织，石蜡包埋后常规切片，光学显微镜下观察心肌组织病理情况。

1.7实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测 实时荧光定量PCR检测HMGB1和TLR4 mRNA表达，取心肌组织后Trizol法常规提取细胞总RNA并逆转录合成cRNA。大鼠HMGB1引物和TLR4引物和实时PCR条件均参照郑世翔等〔6〕的研究。所有待检标本设立3个平行孔，各标本HMGB1和TLR4基因定量值取循环数并与相应内参基因CT差值为标准HMGB1和TLR4基因表达量。

1.8统计学方法 采用SPSS19.0统计软件进行t、F检验，Pearson相关分析。

2 结 果

2.1各组心肌组织病理观察 正常对照组和假手术组心肌基本正常，模型12、24、48 h组大鼠可见心肌细胞水肿，炎症细胞浸润，间质血管充血，心肌细胞坏死明显。见图1。

图1 各组心肌病理学改变(HE，×400)

2.2各组心肌组织HMGB1和TLR4蛋白和mRNA表达 模型12、24、48 h组心肌组织HBGB1的OD值和TLR4蛋白和mRNA明显高于正常对照组和假手术组(P<0.05)，其中模型24 h组心肌组织HBGB1的OD值和TLR4蛋白和mRNA明显高于模型12、48 h组(P<0.05)。见图2和表1。

2.3相关性 HMGB1 mRNA和TLR4 mRNA相对表达量呈正相关(r=0.611，P<0.05)。

图2 各组心肌组织HMGB1免疫组化染色(×400)

组别HMGB1 OD值TLR4(ng/ml)HMGB1 mRNATLR4 mRNA正常对照组0.243±0.08410.22±1.431.000±0.0111.000±0.010假手术组0.231±0.09010.45±1.500.998±0.0101.000±0.090模型12 h组0.581±0.1141)2)17.84±4.241)2)2.104±0.2011)2)2.404±0.3111)2)模型24 h组0.846±0.1031)2)3)24.18±4.101)2)3)3.511±0.4141)2)3)3.671±0.5011)2)3)模型48 h组0.622±0.0971)2)3)4)20.25±3.841)2)3)4)1.712±0.1241)2)3)4)1.821±0.2141)2)3)4)F/P值12.034/<0.0511.816/<0.058.114/<0.059.465/<0.05

1)与正常对照组比较:；2)与假手术组比较；3)与模型12 h组比较；4)与模型24 h组比较:均P<0.05

3 讨 论

脓毒症主要是指机体对感染的特异性反应进而诱发多器官功能障碍，其中心肌损伤是重要表现，具有病情严重、进展速度快等特点，可对患者的预后产生直接影响〔7〕。心脏收缩和舒张功能损害以心脏扩大、左室射血分数下降为主要特征，是脓毒症心肌损伤的主要表现，而诱发心肌损伤的机制较复杂，目前仍不明确，主要为以下几点：①线粒体功能障碍；②细胞因子和细菌毒素作用；③心肌细胞Ca2+超载；④肾素-血管紧张素系统激活；⑤心肌细胞凋亡等〔8～10〕。本研究结果说明脓毒症大鼠体内存在较强的炎症反应。HMGB1主要作为促炎症因子对免疫反应进行介导，相关实验也证实脓毒症患者体内血清HGMB1水平显著升高并提示HMGB1可阻断胰高血糖素样肽(GLP)诱导的脓毒症或内毒素血症，进而提高小鼠的生存率〔11〕。TLR4在人体内分布广泛，主要分布在外周血白细胞和淋巴组织，在心肌细胞和微血管内皮细胞中也有分布，参与宿主防御功能细胞上均存在TLR4表达〔12〕。研究〔13〕发现动脉粥样硬化、心肌缺血/再灌注损伤、心力衰竭等均有TLR4在心血管方面发挥作用。本研究结果说明HMGB1和TLR4在脓毒症大鼠心肌组织中表达上调，可能在脓毒症心肌损伤中有重要作用。

心肌组织中HMGB1水平升高主要有以下三方面的原因：①被白细胞介素(IL)-1、肿瘤坏死因子(TNF)-α和脂多糖(LPS)等激化的巨噬细胞、单核细胞、自然杀伤细胞及内皮细胞等通过时间-剂量依赖的方式将核内HMGB1释放到细胞外；②组织损伤、坏死细胞、再灌注损伤及缺氧等导致细胞核内的HMGB1被动释放；③活化的中性粒细胞和单核细胞促进HMGB1等多种细胞因子的合成与分泌并通过正反馈效应导致机体炎症反应甚至延长机体炎症反应〔14〕。TLR4在脓毒症心肌损伤过程中亦发挥重要的作用，可通过对Bcl-2/Bax、Fas/Fas配体等凋亡相关基因的调控进而促进心肌细胞凋亡，加重心肌损伤；TLR4还可介导信号通路激活核因子(NF)-κB，增加IL-1和TNF-α等炎症介质的产生和释放，诱发全身炎症反应综合征(SIRS)而最终导致脓毒症〔15〕。本研究中大鼠心肌组织中HMGB1和TLR4表达上调证实两种蛋白与脓毒症存在一定的相关性，并提示可能通过调控HMGB1和TLR4蛋白表达来预防脓毒症心肌损伤。