养心氏片对心力衰竭大鼠心肌凋亡的影响

郭志刚 于春霞 宋新旗

(黄河科技学院，河南 郑州 450063)

研究表明，心肌细胞凋亡是导致心力衰竭发生与发展的重要病理基础，心力衰竭的心肌细胞与神经内分泌系统的活动密切相关〔1，2〕。连接蛋白(Cx)43是构成心肌细胞间缝连接通道，在心肌细胞膜上Cx43存去磷酸化和磷酸化两种状态，有效调控细胞间缝连接〔3〕。有研究显示，在心力衰竭患者心肌细胞中Cx43磷酸化(P-Cx43)水平异常升高，关闭细胞间缝连接，增强Cx43降解，进而影响细胞间信号转导〔4〕。养心氏片由人参、黄芪、灵芝、淫羊藿、当归、山楂、丹参、延胡索、地黄、葛根、灸甘草、黄连组成，有化瘀止痛、益气活血的功效，其组方强调以通为养、以补为养、以安为养，是重要的中成药制剂〔5,6〕。本研究分析养心氏片对心力衰竭大鼠心肌凋亡的影响及其机制。

1 资料与方法

1.1药物 盐酸阿霉素(RD7121，德国Ruibio)，使用生理盐水溶解，剂量为2 mg/kg。地高辛片(H31020678，上海信谊药业)，用生理盐水溶解，剂量为0.02 mg/kg。养心氏片(080501，青岛国风药业)，用蒸馏水配制，剂量为37.5 mg/kg。

1.2试剂与仪器 本研究中使用倒置荧光显微镜系统(奥林巴斯)、Medlab-U/8c生物信号采集分析系统(美易)、DYY-7C型电泳仪(六一仪器厂)、Model-680型酶标仪(BIO-BAD)、微量台式离心机(BECKMAN)、紫外可见分光光度计(UV-3200PCS)、Masson三色染色液(Leagene)、脑钠肽(BNP)酶联免疫试剂盒(博美生物)、Rabbit-Anti-GAPDH(博美生物)、山羊抗兔抗体(H+L)(博美生物)、白细胞介素(IL)-6及肿瘤坏死因子(TNF)-α试剂盒(博美生物)、肌钙蛋白(cTn)I酶联免疫试剂盒(博美生物)、TUNEL细胞凋亡试剂盒(碧云天)，其余试剂均为分析纯。

1.3动物及分组 SD大鼠购自南京青龙山实验动物中心，体质量(200±20)g，大鼠均适应性喂养1 w。将所有大鼠随机分为正常对照组(空白组)、模型组、养心氏片组、地高辛组，每组6只。模型组每周相同时间点注射一次阿霉素，浓度为2 mg/kg，持续干预6 w。养心氏片组、地高辛组均采用模型组方式进行造模，造模3 w后每日相同时间点给药。养心氏片组大鼠灌胃给药，给药浓度37.5 mg/kg，地高辛组大鼠灌胃给药，给药浓度0.02 mg/kg。其余组灌胃等体积生理盐水。

1.4样本制备及心功能检测 本组研究中，利用生物信号系统在6 w后检测大鼠心率(HR)、左室舒张期末压(LVEDP)、左室峰压(LVSP)、左室内压变化速率(dp/dtmax)，检测时稳定15 min，并记录0.5 h。再记录完成后，颈总动脉取血，3 000 r/min离心10 min，后-80℃分装保存，用于检测生化指标。取大鼠心脏并称重，计算大鼠心重/体重(HW/BW)比值，暴露心室心底部及心尖部，其中心底部使用多聚甲醛固定，用Masson染色观察胶原纤维增生及形态学情况，使用Western印迹检测心尖部P-Cx43及β-actin水平，所有过程严格遵照试剂盒说明书进行操作。

1.5心肌细胞凋亡检测 利用TUNEL检测试剂盒检测大鼠心肌组织凋亡细胞。光学显微镜下凋亡细胞细胞核呈黄色(阳性)，正常细胞呈蓝色(阴性)。每只大鼠随机选取4张切片，400倍光学显微镜下每张切片观察5个视野，计算凋亡细胞占比，取其均值作为心肌细胞凋亡指数(AI)。

1.6统计学方法 应用SPSS19.0统计软件，采用单因素方差分析多组数据，使用S-N-K法行两两比较，Pearson法单因素直线回归分析变量间相关性，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1大鼠血流动力学变化 模型组LVEDP水平显著高于空白组(P<0.05)，HR、LVSP、dp/dtmax水平明显低于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)，地高辛组及养心氏片组大鼠LVEDP水平均显著低于模型组(P<0.05)，HR、LVSP、dp/dtmax水平明显高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，养心氏片组大鼠LVEDP水平显著低于地高辛组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血流动力学结果

与空白组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；与地高辛组比较：3)P<0.05，下表同

2.2大鼠血中炎症因子及HW/BW水平 模型组BNP、cTnI、IL-6、TNF-α、HW/BW均显著高于空白组(P<0.05)，地高辛组及养心氏片组BNP、cTnⅠ、IL-6、TNF-α、HW/BW均显著低于模型组(P<0.05)，养心氏片组大鼠BNP水平显著高于地高辛组(P<0.05)。见表2。

表2 大鼠血中炎症因子及HW/BW水平检测结果

2.3心肌胶原纤维检测结果 模型组大鼠心肌细胞胶原容积分数及AI显著高于空白组(P<0.05)，地高辛组及养心氏片组大鼠心肌细胞胶原容积分数及AI显著低于模型组(P<0.05)。见表3。

表3 心肌胶原纤维及心肌细胞凋亡结果

2.4左心室P-Cx43表达 模型组大鼠P-Cx43/β-actin水平显著高于空白组(P<0.05)，地高辛组及养心氏片组大鼠P-Cx43/β-actin水平明显低于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.5心肌细胞凋亡程度与P-Cx43水平的相关性 Pearson线性分析结果显示，P-Cx43/β-actin水平与大鼠心肌细胞凋亡呈显著正相关关系(P<0.05)。见图2。

图1 P-Cx43水平检测结果

图2 心肌细胞凋亡程度与P-Cx43水平相关性

3 讨 论

心力衰竭的临床发病机制复杂，神经内分泌系统、心室重构、体液因子等均与心力衰竭的发生与发展密切相关〔7〕。BNP是体内重要的肽类激素，左心室心肌细胞是BNP合成与分泌的主要细胞〔8〕。有研究指出，当心功能异常出现衰竭后，BNP在血浆中的水平异常升高〔9〕。cTn在骨骼肌及心肌中广泛存在，其包含三种亚型，具有不同的蛋白结构并由不同基因编码，cTnI亚型属于是心肌细胞特有，具有高度特异性，可作为评估心肌损伤的高特异性、高灵敏度的心肌损伤标志〔10〕。有研究指出，TNF-α在心力衰竭的发生与发展过程中起到十分重要的作用，可作为预测心力衰竭的独立因子〔11〕。在心力衰竭过程中，TNF-α可能参与血管扩张、心肌抑制、心肌纤维化及左室重构等诸多病理过程中。有研究显示，在心力衰竭患者血中IL-6表达水平显著增加，且心力衰竭严重程度与IL-6表达水平密切相关〔12〕。

程序性细胞死亡又称为细胞凋亡，指在基因严格调控下的细胞主动性死亡过程〔13〕。虽然半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族史调控细胞凋亡的重要蛋白，而有学者指出在心肌细胞凋亡过程中，P-Cx的异常升高与之密切相关，P-Cx在心肌细胞间的化学信息交流及电耦联过程中起到十分重要的作用〔14〕。在心力衰竭的发生与发展过程中，心肌细胞的凋亡起到十分重要的作用。在评价心功能指标中，dp/dtmax及LVSP是重要的指标，可有效评估心肌收缩功能，其值与心肌收缩功能呈正相关关系，LVEDP是有效评估心室泵血的前负荷的重要指标，心肌舒张功能与LVEDP值呈明显负相关关系〔15〕。

本组研究表明，心力衰竭大鼠LVSP、dp/dtmax水平显著降低，LVEDP水平显著升高，提示心肌舒张及收缩功能显著降低。此外，心力衰竭大鼠HW/BW及血浆中cTnⅠ、BNP、IL-6、TNF-α水平均显著升高。Masson染色结果显示，心力衰竭大鼠可见明显的心肌细胞受损，心肌细胞胶原容积分数增高。TUNEL染色结果，心力衰竭大鼠的心肌细胞阳性细胞核明显增高，左心室心肌组织中P-Cx43水平也呈明显升高状态，且心肌细胞凋亡与P-Cx43表达水平呈正相关。与心力衰竭组相比，地高辛组及养心氏片组大鼠心脏LVSP、LVEDP及dp/dtmax水平均显著改善，且HW/BW及血浆中cTnI、BNP、IL-6、TNF-α水平也得以明显改善。深入分析左心室心肌组织P-Cx43的表达情况，结果显示左心室心肌P-Cx43的表达也显著降低，其结果与心肌细胞凋亡结果一致。

综上所述，养心氏片对可通过调控P-Cx43的表达而改善心力衰竭大鼠的心肌凋亡，并提高大鼠心功能，减轻心肌细胞纤维化及心室重构。