阿托伐他汀对1型糖尿病大鼠肾损伤的保护作用及机制

胡琼丹 胡柯琴 樊均明

(西南医科大学附属中医医院肾病内科，四川 泸州 646000)

糖尿病的高血糖状态能够诱发肾组织血管产生炎症病变，同时伴有显著的血管内皮细胞改变，包括肾内血管通透性增加、小球基底膜增厚等〔1～4〕。转化生长因子(TGF)-β/Smad与1型糖尿病患者体内肾脏纤维化、肾脏的病理损伤密切相关〔5〕。齐淑芳等〔6〕证明了山楂叶总黄酮能够通过TGF-β/Smad通路抑制1型糖尿病大鼠肾脏纤维化，减轻糖尿病肾脏所受的损害。羟甲基戊二酰辅酶(HMG-Co)A还原酶抑制剂能够降低肾内炎症性因子水平，从而抑制肾内炎症反应，保护肾血管内皮细胞〔7〕。本研究旨在探讨阿托伐他汀(ATO)对糖尿病大鼠肾损伤的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1动物与分组 40只健康雄性成年SD大鼠，购自上海灵畅生物科技有限公司，实验动物生产合格证号：SCXK(沪)2013-0018，体重260～300 g，平均(281.82±11.75)g，实验室温度20～24℃，正常光照，自由饮食、活动，适应性饲养1 w。随机分为A组(健康对照组)，B组(糖尿病模型组)，C组(健康大鼠ATO干预组)，D组(糖尿病大鼠ATO干预组)各10只。

1.2试剂与设备 链尿佐菌素(STZ，美国sigma公司)，ATO钙片(美国辉瑞公司)，化学发光免疫分析法(CLIA)试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)，全自动生化分析仪(ES-380，南京颐兰贝生物科技有限责任公司)，酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(上海邦奕生物科技有限公司)，RIPA蛋白裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(美国Thermo公司)，兔抗大鼠Smad2多克隆抗体、兔抗大鼠TGF-β1单克隆抗体、兔抗大鼠GAPDH单克隆抗体(美国Santa公司)，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗、生物素标记羊抗兔IgG(上海英基生物科技有限公司)，ECL发光液(美国Millipore公司)，凝胶成像仪(美国UVP公司)，分光光度计(上海奥析科学仪器有限公司)，其他试剂均采用国产分析纯。

1.3方法

1.3.1模型制备 糖尿病组大鼠(B组与D组)，隔夜禁食12 h，每24 h腹腔注射STZ(55 mg/kg)，A组与C组同时腹腔注射同等剂量的生理盐水，注射两次。STZ处理48 h后，每只大鼠均随机检测2次尾静脉血的血糖浓度，稳定高于16.7 mmol/L，表明模型建立成功。建模成功后，进行ATO干预：C组与D组将ATO钙片溶于生理盐水，制成0.5 mg/ml溶液，按10 mg·kg-1·d-1的剂量灌胃，持续8 w。同时，A组与B组将空白淀粉片溶于生理盐水，制成0.5 mg/ml溶液，按10 mg·kg-1·d-1的剂量灌胃，持续8 w。

1.3.2样本收集 ATO干预后的第1、2、4、8周，收集各组大鼠的24 h尿，检测尿白蛋白(UAL)水平；尾静脉采血检测血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)含量。

干预8 w后，各组大鼠采用颈椎脱臼法处死。摘取肾脏，预冷的生理盐水冲洗后，-20℃保存，左侧肾组织预备用于检测炎症因子水平，另一侧肾组织，待提取组织蛋白用于Western印迹检测。

1.3.3生化检查 CLIA法检测尿中UAL含量，全自动全化分析仪检测血清BUN、Scr含量及实验结束时的空腹血糖值。

1.3.4ELISA检测相关指标 ELISA检测肾组织中白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10、前列腺素(PG)E2、肿瘤坏死因子(TNF)-α和C反应蛋白(CRP)水平。上述实验均严格按照试剂盒说明进行操作。

1.3.5Western印迹法检测TGF-β1和Smad2蛋白表达 取各组大鼠的肾组织，加入RIPA蛋白裂解液，匀浆后，提取组织总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白，采用湿转法将蛋白转到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室温下5%脱脂奶粉振荡封闭1 h，TBS-T洗膜，兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体，兔抗大鼠Smad2多克隆抗体，兔抗大鼠GAPDH单克隆抗体，4℃孵育过夜。TBS-T洗膜，加入HRP标记的羊抗兔二抗，室温孵育1 h，加ECL发光液进行化学发光显影，采用凝胶成像仪对蛋白条带进行观察，获取图像，采用Image Lab软件对图像进行灰度分析，记录灰度值，同时计算目的蛋白与内参蛋白的灰度比值。

1.4统计学处理 应用SPSS20.0软件进行方差分析(ANOVA)、LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组大鼠体重和空腹血糖情况 单因方差分析显示8 w实验结束后，各组大鼠的体重和空腹血糖比较差异有统计学意义(P<0.05)。D组大鼠体重明显高于B组，但明显低于A组和C组，差异均有统计学意义(P<0.05)，C组与A组比较差异无统计学意义(P>0.05)；同时，B组与D组空腹血糖明显高于A组，差异均有统计学意义(P<0.05)，但D组与B组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 实验结束时各组大鼠体重、空腹血糖比较

1)，2)，3)分别为与A，B，C组比较：P<0.05，下表同

2.2各组大鼠肾组织中炎症因子的变化 单因素方差分析显示，8 w实验结束后，各组大鼠之间的肾内炎症因子水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。与B组相比，D组大鼠肾组织中的炎症因子(IL-1β、IL-6、IL-10、PGE2、TNF-α、CRP)水平显著降低(P<0.05)，且与A组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)；而C组大鼠肾组织中炎症因子的水平与A组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3各组大鼠肾功能的变化情况 经两因素重复测量方差分析发现，各指标组间整体差异均有统计学意义(P<0.05)，而时间及分组与时间的交互作用差异无统计学意义(P>0.05)。实验的8 w全过程中，A组与C组大鼠的肾功能各项指标差异均无统计学意义(P>0.05)。与A组相比，B组大鼠UAL、BUN、Scr水平显著升高(P<0.05)；与C组相比，D组大鼠肾组织中UAL、BUN、Scr水平显著升高(P<0.05)。在第1周和第2周时，D组大鼠肾组织中UAL、BUN、Scr水平与B组相对接近，实验第4周和第8周，D组肾组织中UAL、BUN、Scr水平显著低于B组(P<0.05)，但仍明显高于A组(P<0.05)。见表3。

表2 各组大鼠肾内炎症性因子水平比较

2.4各组大鼠肾脏组织TGF-β1和Smad2蛋白的表达 Western印迹法结果经单因素方差分析显示，各组大鼠肾脏组织TGF-β1和Smad2蛋白的表达差异均有统计学意义(P<0.05)。D组肾组织中TGF-β1蛋白的相对表达水平低于B组(P<0.05)，但仍然高于A组(P<0.05)。TGF-β1蛋白的相对表达水平A组与C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。D组肾组织中Smad2蛋白的相对表达水平低于B组(P<0.05)，但仍然高于A组(P<0.05)，Smad2蛋白的相对表达水平在A组与C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4、图1。

表3 各时相点大鼠的肾功能的指标变化情况

1)，2)，3)分别为和A，B，C组相比：P<0.05；4)为和第1周相比：P<0.05；下表同

表4 各组大鼠肾脏组织TGF-β1和Smad2蛋白相对表达量比较

图1 各组大鼠肾脏组织TGF-β1和Smad2蛋白表达水平

3 讨 论

研究表明，糖尿病可导致多组织的慢性损害、功能障碍，如眼、肾、心脏、血管、神经等，由糖尿病并发症导致的死亡仅次于心脑血管疾病和恶性肿瘤〔8，9〕。糖尿病按其发病原因可大致分为胰岛素分泌缺陷或(和)胰岛素作用缺陷。其中I型糖尿病是糖尿病的一种重要分型，属于自身免疫性疾病，以胰岛β细胞被进行性破坏为特点，表现为胰岛素分泌的绝对减少。广谱抗生素STZ具有对胰岛β细胞的选择性毒性，能够引起胰岛素的绝对分泌不足，因而被广泛用作糖尿病动物模型的诱导剂。STZ已被证实能够稳定、高效地诱导建立大鼠1型糖尿病模型。

近年来，应用非经典糖尿病药物防治糖尿病并发症是糖尿病研究领域的热点。有研究认为，他汀类药物对糖尿病患者肾脏具有保护作用〔10〕。本研究发现，ATO能够增加糖尿病大鼠的体重，但对糖尿病大鼠的空腹血糖并无影响。

经STZ诱导建立1型糖尿病模型后，肾功能受到明显损害〔11〕，而单纯ATO干预并不会影响健康大鼠的肾脏功能。从第4周开始，D组大鼠肾功能指标都较B组有所回落，提示经ATO干预后大鼠的肾脏功能有所恢复。可见ATO能够减轻糖尿病对大鼠肾脏造成的损害〔12〕。

本研究表明ATO能够减少糖尿病大鼠肾脏组织内炎症性因子〔13,14〕，从而降低糖尿病肾脏中的炎症水平，同时并不会影响到正常健康的大鼠。已有研究证实，TGF-β1/Smads信号通路参与了糖尿病肾病的病情进展过程〔15,16〕，TGF-β1过表达多会促进糖尿病肾脏纤维化的发生〔17〕。本研究提示ATO能够选择性抑制TGF-β1/Smads信号通路活化。本研究推测，当大鼠被STZ诱导建立起糖尿病模型后，TGF-β1/Smads信号通路活性增加，从而对肾脏造成一定的损害。当ATO干预后，由于其能够抑制TGF-β1/Smads信号通路，糖尿病肾脏所受损害在一定程度上得到了减轻。这可能也是ATO改善糖尿病大鼠肾功能的一种机制。

综上所述，ATO能够增加糖尿病大鼠的体重，并且不影响其空腹血糖；能够减少糖尿病对肾脏的损害，保护肾脏，减少糖尿病肾病的发生。单纯ATO干预不会对健康大鼠造成肾脏方面的不良影响，这为今后拓展糖尿病控制、治疗的研究提供了新的方向。