COPD肺部炎症反应与血管重构中PPAR-α及TLR4表达的关系

王 旭 邹新中 张彩娣 左志通 陈宝华

(无锡市第三人民医院呼吸科，江苏 无锡 214041)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是我国高发的呼吸系统疾病，致死率和自残率均很高〔1〕。目前，肺实质和肺血管中的慢性炎症反应和血管重构是医学界公认的COPD发病基础。炎症反应可引发支气管壁损伤-修复过程反复进行，诱导血管重构，而在此过程中过氧化物酶体增殖体激活受体(PPAR)和Toll样受体(TLR)发挥重要作用〔2〕。动物实验显示，PPAR-α在支气管哮喘小鼠的血管重构过程中发挥明显调控作用〔3〕；TLR4可通过介导炎性反应来影响ACEⅡ所致高血压小鼠体内血管重构〔4〕，然而PPAR-α及TLR4在COPD患者肺血管重构中的作用尚不清楚。本次研究以人体肺组织标本为研究对象，检测COPD患者与非COPD患者肺组织中PPAR-α及TLR4表达情况，探讨其在炎性反应和血管重构中的作用机制。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2014年6月至2015年10月无锡市第三医院院行手术治疗的肺鳞癌患者62例。术中在切除肺叶的同时收集远离癌组织的正常肺组织为研究标本。根据术前患者肺功能指标并依据COPD诊断标准，将入选患者分为COPD组30例，非COPD组32例。COPD组中男27例，女3例，年龄58～81岁，平均(67.92±7.08)岁；非COPD组中男27例，女5例，年龄57～79岁，平均(67.35±5.41)岁。两组患者性别、年龄之间差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2主要试剂 Trizol试剂盒购于上海法默生物科技有限公司；RIPA试剂盒购于上海闪晶分子生物科技有限公司；兔抗人PPAR-α抗体、兔抗人TLR4抗体、鼠源性β-actin单抗、辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗购于上海信裕生物科技有限公司。

1.3研究方法

1.3.1肺组织形态学观察 术中收集的肺组织标本常规行石蜡包埋，0.3 μm连续切片，脱蜡至纯水中，苏木素-伊红(HE)染色，封片并观察。肺动脉直径观察范围为150～450 μm，同时评价肺动脉及其周围炎性细胞浸润程度。评价标准：0分为无浸润；1分为存在少量炎性细胞浸润；2分为炎性细胞浸润较多，但分布不均匀；3分为炎性细胞浸润较多且分布均匀，但未出现聚团现象；4分为炎性细胞浸润分布均匀且聚团。随机选出6条横断面形态完整的肺小动脉，测量管壁厚度、面积、内径和外径，计算肺小动脉血管壁横断面面积与血管总面积的比值(WA%)，小动脉血管壁厚度与外径的比值(WT%)。

1.3.2RT-PCR法检测肺组织PPAR-α和TLR4 mRNA表达 Trizol法提取两组患者肺组织总RNA用分光光度法测定浓度，逆转录试剂盒获得cDNA。引物由上海鲁汶生物科技有限公司合成，总反应体系20μl，反应条件：94℃ 10 min，94℃ 5 min，56℃ 50 s，72℃ 1 min，共40个循环，72℃延伸10 min。扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，扫描得到目标条带灰度值，以β-actin为内参计算PPAR-α、TLR4 mRNA的相对表达量。

1.3.3Western印迹法检测肺组织PPAR-α和TLR4蛋白表达 RIPA试剂盒提取肺组织总蛋白70 g，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法测定蛋白浓度，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，转膜到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，脱脂奶粉封闭2 h后分别滴加兔抗人PPAR-α、TLR4一抗(1∶500稀释)，鼠源性β-actin单抗(1∶1 000)为内参，4℃冷藏孵育过夜，滴加HRP标记的二抗，孵育4 h，电化学发光(ECL)显色，暗室中显影、采集图像，分析各条带灰度值。

1.3.4免疫组化法检测肺组织PPAR-α和TLR4阳性细胞比例与分布 取两组患者肺组织石蜡切片，脱蜡、热修复抗原，H2O2封闭内源性过氧化物酶30min，滴加兔抗人PPAR-α、TLR4一抗，4℃冷藏过夜，滴加生物素标记的二抗，37℃孵育2 h，二氨基联苯胺(DAB)显示、苏木精复染，封片固定，采集图片并使用Image pro Plus 5.0软件分析。

1.4统计学分析 使用SPSS16.0软件进行t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1肺组织形态学和血管炎症及重建程度比较 HE染色后显微镜下观察，COPD组肺组织中肺泡形态和支气管黏膜不完整，肺小动脉血管壁及周围存在明显炎性细胞浸润；非COPD组肺泡结构和支气管黏膜完整，小动脉血管壁结构完整，且无明显增厚，周围未发现或极少量炎性细胞浸润(见图1)。COPD组炎症评分明显高于非COPD组(P<0.01)；COPD组WA%、WT%明显高于非COPD组差异均有统计学意义(P<0.01)。见表1。

2.2两组患者肺组织中PPAR-α及TLR4 mRNA和蛋白表达情况 RT-PCR检测显示，COPD组PPAR-α mRNA相对表达量为1.62±0.58，明显低于非COPD组的3.85±0.74；COPD组TLR4 mRNA相对表达量为2.30±0.35，明显高于非COPD组的0.91±0.27；差异均有统计学意义(P<0.01)。Western印迹检测显示，COPD组PPAR-α 蛋白相对表达量为14.38±1.96，明显低于非COPD组的20.65±0.42；COPD组TLR4蛋白相对表达量为25.71±0.39，明显高于非COPD组的17.24±0.50；差异均有统计学意义(P<0.01)。见图2。

表1 两组肺组织血管炎症及重建程度比较

与非COPD组比较：1)P<0.01

图1 两组患者肺组织HE染色(×400)

图2 Western印迹检测肺组织中PPAR-α及TLR4蛋白表达

2.3PPAR-α和TLR4阳性细胞表达及分布情况 免疫组化检测显示，PPAR-α和TLR4阳性反应均为棕黄色颗粒，两者主要表达于肺血管平滑肌细胞的胞质和胞核。COPD组PPAR-α阳性细胞比例为(13.15±4.93)%，明显低于非COPD组的(31.38±6.04)%(P<0.01)。COPD组TLR4阳性细胞比例为(27.30±6.42)%，明显高于非COPD组的(15.53±4.05)%(P<0.01)。见图3。

图3 两组PPAR-α和TLR4免疫组化检测(×400)

3 讨 论

COPD发病与外部环境中有害物质刺激肺部导致非正常性炎症反应有关，病理特征以肺部血管和气道重构造为主。本次研究中，COPD患者肺小动脉血管壁厚度和明显小于非COPD患者，WA%、WT%明显高于非COPD患者，提示肺部血管重构中肺小动脉血管重构明显。相关研究显示，COPD患者肺部血管重构主要因肺部缺氧导致〔5〕；而最新研究发现，COPD发病早期就已出现肺部血管重构，在肺部未出现缺氧时已发生炎症反应〔6〕，提示肺部炎症反应可能是引发肺部血管重构的起始原因。本次研究显示，存在肺小动脉血管的COPD患者肺部炎性细胞浸润程度明显高于非COPD患者，同时炎症评分明显增高。

COPD发病过程中体内多种影响炎症反应的细胞因子可发挥促进或抑制作用。动物实验显示，PPAR-α可通过影响AP-1、STAT等因子转录来抑制支气管哮喘小鼠的血管重构，呈明显的负相关〔7〕。以此为基础，本次研究对PPAR-α在COPD患者肺组织中的作用进行了分析，结果显示COPD患者肺组织中PPAR-α mRNA和蛋白表达水平均较非COPD患者明显降低，PPAR-α阳性细胞比例也明显低于非COPD患者。提示人肺部PPAR-α表达下调可降低抗炎作用，促进肺部血管重构。TLR4属于Ⅰ型跨膜糖蛋白的免疫分子，能够经病原微生物与细胞壁产物之间的作用激活免疫系统。相关研究显示，TLR4可通过介导炎性反应来影响ACEⅡ所致高血压小鼠体内血管重构〔8〕，但其在COPD患者肺部血管重构中的作用仍鲜有报道。本次研究显示，COPD患者肺组织中TLR4 mRNA和蛋白表达水平均较非COPD患者明显升高，PPAR-α阳性细胞比例也明显高于非COPD患者，提示人肺部TLR4表达上调可促进炎性反应，加快肺部血管重构。

综上所述，COPD组患者肺血管均出现不同程度的重构，PPAR-α抗血管重构的机制与减轻炎症对血管损伤有关；TLR4参与血管重构的机制与加重炎症反应，促进血管壁细胞外基质增加有关。