干预Bcl-2基因表达对骨肉瘤细胞侵袭、迁移能力的影响

张保龙 马利阁 尹万乐 李 达 宗淑君 王 芳 段小珍 尤笑迎

(郑州人民医院骨三科，河南 郑州 450000)

骨肉瘤是一种多发于青少年或儿童的恶性骨肿瘤，发病率高，易转移和复发〔1，2〕。目前常用的治疗方法是手术、化疗、放疗等，但预后较差，其主要原因是出现远端转移和复发〔3，4〕。骨肉瘤细胞的侵袭、迁移受多种转移基因的影响，但其转移的分子机制尚不完全清楚。研究表明，B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2在骨肉瘤组织中的表达量高于正常组织，对骨肉瘤的发生、发展起重要作用〔5〕。本实验拟分析下调Bcl-2基因对骨肉瘤细胞侵袭、迁移能力的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1实验主要试剂及仪器 人骨肉瘤细胞系MG-63购自中国科学院上海细胞库，DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素购自美国HyClone公司，LipofectamineTM2000转染试剂购自美国Invitrogen公司，胰蛋白酶、Matrigel基质胶、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自上海Solarbio公司，RIPA裂解液购自南京碧云天生物技术有限公司，细胞培养板、Transwell小室购自美国Costar公司，Bcl-2抗体、β-连环蛋白(catenin)抗体、c-Myc抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司，β肌动蛋白(β-actin)抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗购自美国Cell signaling公司，倒置显微镜购自日本Olympus公司，台式高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司，凝胶成像仪购自上海天能凝胶成像系统公司。

1.2细胞培养 将MG-63冻存管取出，在37℃水浴锅中溶化30 s，加入5 ml DMEM培养基，离心，收集细胞至培养瓶中，在5% CO2、37℃、饱和湿度培养箱中培养过夜。每天在显微镜下观察细胞的生长状态，每2～3 d更换1次培养液。待细胞生长汇合度达80%左右，加入胰酶消化细胞，进行传代，每隔2 d传代1次。

1.3细胞转染 转染前1 d，选取生长状态良好的对数期细胞，消化、离心，加入不含抗生素的DMEM培养基，每孔5×105个细胞接种于6孔板中，在细胞培养箱中培养，待细胞汇合度达80%左右开始转染。将500 μl Opti-MEM培养基和2 ml siRNA-NC(50 nmol/L)或siRNA-Bcl-2(50 nmol/L)混匀，加入LipofectamineTM2000，室温静置20 min，将混合液加入6孔板中，置于培养箱中培养4 h后，更换完全培养基，48 h后进行其他实验。实验分为空白组、MG-63 NC组(转染siRNA-NC)和MG-63-siRNA组(转染siRNA-Bcl-2)，Western印迹检测转染效果。

1.4Transwell法检测细胞迁移能力 0.25%胰酶消化对数期细胞，200 μl不含血清的培养基和1×104个细胞接种到Transwell小室中，将小室置于24孔板中，加入500 μl 10%胎牛血清的培养基于24孔板中，培养箱中继续培养24 h后，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗小室，棉签轻轻拭去小室中的细胞，1%甲醇固定小室细胞10 min，苏木精染色5 min，在倒置显微镜下观察穿过滤膜表面的细胞，每组5个复孔，选取5个视野，取平均值，实验重复3次。

1.5Transwell法检测细胞侵袭能力 实验前，将Matrigel基质胶融化为液体，以1∶9的比例加入无血清培养基稀释Matrigel胶，加入50 μl稀释好的Matrigel胶包被Transwell小室底部，37℃通风3 h，细胞提前使用无血清培养基培养12 h，0.25%胰酶消化对数期细胞，将1×104个细胞接种到Matrigel胶包被的Transwell小室中，24孔板中加入500 μl含10%胎牛血清的培养基，放入37℃细胞培养箱继续培养24 h，棉签擦去小室中的细胞，使用1%甲醇固定10 min，苏木精浸泡5 min，取5个视野，观察细胞的数量，每组5个复孔，取平均值。

1.6Western印迹检测细胞中β-catenin、c-Myc蛋白表达水平 胰酶消化细胞，将细胞密度调整为1×106个/ml，加入200 μl预冷的细胞裂解液，在冰上放置15 min，离心，取上清，考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。取50 μg蛋白上样缓冲液混合均匀，置于沸水中变性5 min。将10%的分离胶加入凝胶玻璃板中间，配置6%的浓缩胶，加入样品蛋白，80 V电泳至样品进入浓缩胶，调整电压至100 V，待溴酚蓝迁移至分离胶底部，停止电泳。切下目的蛋白条带，加入电泳缓冲液，将蛋白质转移至NC膜上。将转膜后获得的BC膜置于10 ml 5%脱脂牛奶封闭1 h。加入1%脱脂牛奶稀释的一抗，4℃过夜。Tris盐酸缓冲液(TBST)清洗3～4次，每次5～10 min，加入适量稀释的辣根过氧化物酶标记二抗，37℃结合2 h，TBST洗膜3～4次，每次5～10 min。暗室中与显影液反应1 min，定影10～15 min，清水冲洗晾干，以β-actin为对照，凝胶成像仪分析目的蛋白的表达量。

1.7统计学分析 采用SPSS22.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1siRNA-Bcl-2转染后骨肉瘤细胞中Bcl-2的表达 Western印迹检测发现，MG-63-siRNA组Bcl-2蛋白表达量(0.352±0.066)明显低于空白组(0.684±0.074，P<0.05)，而MG-63 NC组(0.701±0.083)和空白组差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

图1 siRNA-Bcl-2转染后骨肉瘤细胞中Bcl-2的表达

2.2干预Bcl-2基因表达对骨肉瘤细胞迁移能力的影响 MG-63-siRNA组穿过Transwell小室的细胞数〔(43.852±3.752)个〕较空白组〔(82.489±6.522)个〕显著降低(P<0.05)，而MG-63 NC组〔(85.487±4.123)个〕与空白组差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3干预Bcl-2基因表达对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响 MG-63-siRNA组细胞的侵袭数目〔(13.225±1.658)个〕较空白组〔(45.685±2.289)个〕显著降低(P<0.05)，而MG-63 NC组〔(42.587±3.145)个〕与空白组差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4干预Bcl-2基因表达对骨肉瘤细胞中β-catenin、c-Myc蛋白水平的影响 与空白组相比，MG-63 NC组β-catenin、c-Myc蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)；MG-63-siRNA组显著降低(P<0.05)，见表1，图2。

图2 干预Bcl-2基因表达对骨肉瘤细胞中β-catenin、c-Myc蛋白水平的影响

组别β-catenin/β-actinc-Myc/β-actin空白组1.202±0.3641.252±0.326MG-63 NC组1.336±0.2981.120±0.341MG-63-siRNA组0.574±0.0851)0.462±0.0781)

与空白组比较：1)P<0.05

3 讨 论

骨肉瘤是一种发病率高、致残率高的恶性肿瘤，由于具有较高的侵袭和迁移能力，患者预后较差〔6〕。常见的骨肉瘤治疗方式是手术结合放化疗，但治疗效果并不满意，主要原因是骨肉瘤存在早期转移，多见于肺部转移〔7，8〕。肿瘤的转移是一个复杂的过程，由多种细胞、促转移基因、抑制转移基因共同参与〔9，10〕。促转移基因主要促进肿瘤细胞的侵袭、迁移能力，抑制转移基因主要抑制肿瘤细胞的的侵袭、迁移能力。机体在正常生理状态下，促转移基因和抑制转移基因处于动态平衡状态，但当机体发生病理性变化时，促转移基因和抑制转移基因的动态平衡处于紊乱状态，影响肿瘤细胞的侵袭、迁移能力。既往研究表明，Bcl-2能通过调节细胞的凋亡能力影响肿瘤的发生、发展〔11〕。本实验结果显示，转染siRNA Bcl-2后，细胞中Bcl-2的水平明显下调，而且Bcl-2表达量下降的MG-63细胞的侵袭、迁移能力显著降低。

Wnt/β-catenin信号通路是一种高度保守的Wnt经典通路，调控细胞的各种生命活动〔12〕。在胚胎发育中，Wnt/β-catenin信号通路参与调节细胞及重要器官的生长、分化；在成熟个体中，Wnt/β-catenin信号通路参与细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移等过程〔13〕。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路中重要因子，其表达量水平影响Wnt/β-catenin信号通路的活性。当β-catenin表达量降低时，Wnt信号通路处于未激活状态；当β-catenin水平累积增高，可促进细胞质中的β-catenin进入细胞核中，激活Wnt信号通路，调控下游靶基因的转录和表达〔14〕。研究表明Wnt/β-catenin信号通路参与肿瘤的发生、发展过程，其通路的异常活化可促进下游靶基因c-Myc、细胞周期蛋白(cyclin)D1等的表达，调控肿瘤细胞的生长、分化、侵袭、迁移〔15，16〕。本研究结果提示干预Bcl-2可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路及其下游靶基因c-Myc表达降低MG-63骨肉瘤细胞的侵袭、迁移能力。