中药补阳还五汤对大鼠脑出血神经元凋亡及磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶蛋白表达的影响

孟 杰 刘云霞 吴晓光 李蒙蒙 仇志富 孙大永

(承德医学院附属医院，河北 承德 067000)

脑出血可导致组织发生神经元凋亡，抑制细胞凋亡可以保护脑损伤〔1〕。补阳还五汤是临床上用于治疗脑缺血后遗症的常用药物，具有抗氧化，提高微血管密度，增加脑组织血流量，抑制神经元凋亡、促进神经修复再生等作用〔2～4〕，然而其对出血脑组织细胞凋亡的影响却鲜有报道。本研究观察补阳还五汤对脑出血模型大鼠血肿周围脑组织细胞凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1实验动物、试剂 雄性、成年SD大鼠96只，体重240～280 g(北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK(京)2012-0001)。补阳还五汤(同仁堂承德分公司，批号：2015134)，银杏叶片(北京双鹤药业有限公司，批号：20151013)；兔抗大鼠多克隆抗体Bax、Bcl-2(上海延生实业有限公司)； 转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记(TUNEL)试剂盒(武汉博士德生物科技有限公司)。

1.2模型制作、分组 将大鼠编号及记录体重，按照Rosenberg法〔5〕制备脑出血模型，造模后第2天开始，分别灌胃给予假手术组(等量生理盐水)、模型组(等量生理盐水)、补阳还五汤组(26 g·kg-1·d-1)和银杏叶片组(3.5 mg·kg-1·d-1)，灌胃14 d。按照随机每组24只分为假手术组、模型组、补阳还五汤组、银杏叶片组。

1.3神经功能障碍评分 神经功能行为学评分采用双盲、Garcia〔6〕法。

1.4TUNEL法检测细胞凋亡 严格按照试剂盒操作说明检测凋亡。

1.5免疫组化检测凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表达 脑组织切片(5 μm)，链霉亲和素-生物素复合物(SABC)法免疫组化染色，兔抗大鼠一抗Bax(1∶100)、Bcl-2(1∶150)。图像处理软件(Image pro plus5.01)分析切片，每组6张，每张选取6个不同视野，计算阳性表达积分光密度值(IOD)。

1.6Western印迹检测蛋白磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶(p-ERK)的表达 提取蛋白，定量，每组按照 30 μg 总蛋白上样，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，转膜，封闭，倾去封闭液，滴加稀释好的一抗p-ERK(1∶60)孵育3 h(室温)，磷酸盐缓冲液(PBS)洗膜3次，每次5 min，再滴加二抗，温箱内孵育1 h(37℃)，同法洗膜3次，暗室内用电化学发光(ELC)液显影，最后用Quantity One软件分析统计结果。

1.7统计学处理 利用SPSS19.0软件行单因素方差分析。

2 结 果

2.1神经功能评分 大鼠造模后6 h进行神经功能评分，模型组出现严重的神经功能障碍，无法攀援、追尾，站立不稳，左侧肢体无力等现象；神经功能评分〔(8.24 ±1.56)分〕显著低于假手术组〔(17.32 ±0.76)分〕(P<0.05)。与模型组相比，补阳还五汤和银杏叶片两组评分显著升高〔(12.85±1.62)、(13.01±1.54)分〕(P<0.05)。

2.2TUNEL法检测细胞凋亡数量的变化 假手术组大脑皮质内仅有零星的、散在的TUNEL阳性表达细胞。模型组脑出血组织内阳性细胞数较假手术组明显增加(P<0.05)；与模型组相比，补阳还五汤组和银杏叶片组阳性细胞显著减少(P<0.05)，补阳还五汤组和银杏叶片组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1和表1。

2.3免疫组化检测凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表达 神经元胞质呈棕黄色为阳性表达。假手术组中Bax、Bcl-2的表达很少。补阳还五汤组和银杏叶片组与模型组相比，Bax表达量明显降低，Bcl-2增加，Bcl-2/Bax比值显著升高(P<0.05)。补阳还五汤组与银杏叶片组Bcl-2/Bax比值差异无统计学意义(P>0.05)。见图2和表1。

2.4Western印迹检测p-ERK蛋白表达 与假手术组相比，模型组p-ERK蛋白表达有所增加；补阳还五汤组和银杏叶片组与模型组相比，p-ERK表达增加(P<0.05)，提示补阳还五汤诱导p-ERK表达增加，可能激活下游PI3K/ERK信号通路。见表1和图3。

图1 TUNEL法检测各组脑出血组织中细胞凋亡的表达(×400)

图2 免疫组织化学法检测各组脑出血组织Bcl-2、Bax蛋白表达(×400)

组别p-ERK(灰度值)TUNEL阳性细胞(个/视野)Bcl-2(个/视野)Bax(个/视野)Bcl-2/Bax(个/视野)假手术组5.37±1.260.96±0.055.47±1.754.32±1.721.26±1.02模型组6.81±1.291)6.13±2.511)9.18±2.241)16.81±4.351)0.55±0.521)补阳还五汤组9.78±1.312)3.67±1.282)16.81±4.232)12.17±2.642)1.38±1.602)银杏叶片组9.32±1.472)4.12±1.642)15.28±3.942)11.28±2.572)1.35±1.532)

与假手术组比较：1)P<0.05；与模型组比较:2)P<0.05

图3 各组血肿周围脑组织p-ERK蛋白表达

3 讨 论

脑出血后血肿周围脑组织神经元凋亡的调控通路主要为丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路，在这一通路中，细胞外信号调节激酶(ERK)具有抗凋亡作用，研究表明,ERK在脑缺血后损伤神经的修复过程中发挥重要作用〔7〕。ERK是MAPK信号通路的重要成员，具有调控细胞的生长与分化和调节炎症与细胞凋亡等应激反应的作用〔8〕。ERK是MAPK家族的蛋白激酶，主要在细胞胞质表达，在Raf-1因子的参与下可转位至核内，活化成p-ERK。p-ERK 的激活即可以通过激活蛋白激酶(PK)A信号通路抑制Bad/Bcl-xL二聚合物的形成，也可以抑制Bad蛋白表达，从而可以阻断细胞色素C的释放，进一步抑制细胞凋亡〔9〕。Bcl-2通过阻止线粒体细胞色素C的释放而发挥抗凋亡作用，而细胞凋亡是被认为引起脑出血后神经功能缺损最重要的机制〔10〕。Bcl-2家族包括Bcl-2、Bcl-xL、Bax、Bad 等蛋白，其中Bcl-2和Bcl-xL蛋白具有抑制细胞凋亡的作用，而Bax和Bad 等蛋白具有促进细胞凋亡的作用〔11〕。位于线粒体膜上的Bcl-2/Bax蛋白，调控线粒体功能和凋亡相关蛋白的释放，Bcl-2在Bax和Bcl-2形成异源二聚体时，发挥其抑制细胞凋亡的功能。本研究结果显示，中药补阳还五汤给药后大鼠凋亡细胞数量显著减少，神经功能明显改善。

综上，补阳还五汤可以保护脑出血诱发的神经元

损伤，机制与降低Bax蛋白表达并增加Bcl-2表达，提高Bcl-2/Bax比值而抑制神经元凋亡可能有关。