序列特异性引物联合RT-PCR在LRRK2基因多态性分型中的应用

葛 彪 田改生 李勤学 李冯锐

(内蒙古包钢医院老年病科，内蒙古 包头 014010)

帕金森病(PD)是常见的神经系统退行性疾病，其患病率随年龄增长有增高趋势。LRRK2基因包含51个外显子，编码产物为2 527个氨基酸组成的蛋白，具有GTP酶与蛋白激酶活性，并发现与PD发病相关的路易体形成关系密切。LRRK2在家族性和散发性PD的发病中起一定作用，目前已证实该基因约有20多个疾病相关性位点，其中R1628P、G2385R位点突变在包括中国、新加坡、日本和中国台湾等东亚各国家和地区的散发性PD患者中高发〔1,2〕。而对LRRK2基因功能及突变与PD相关性的研究逐渐成为热点。本研究将RT-PCR技术应用于LRRK2基因R1628P与G2385R位点的基因型分型，期望建立一种方便、快捷、高通量的检测平台，为PD的基础研究与临床诊断提供新方法。

1 材料与方法

1.1主要试剂 SYBR®Prime EX TaqTM Real time PCR试剂盒购自TaKaRa公司；蛋白酶K购自Sigma公司；其余分析纯试剂均购自 Amresco公司；PCR引物委托上海生工生物工程公司合成。

1.2样品来源及DNA提取 中国北方地区汉族人群散发性PD患者100例，均由神经内科学专家依据英国脑库PD诊断标准进行诊断。本研究得到伦理委员会批准，均签署知情同意书。受试对象抽取静脉血1 ml，枸橼酸钠抗凝。4℃离心15 min，收集白细胞，采用常规SDS-蛋白酶K/酚-氯仿法提取基因组DNA。

1.3已知基因型的DNA标准品 本实验室已经在先期研究中验证的LRRK2基因R1628P、G2385R位点基因型的白细胞基因组DNA样品。其中包括R1628P位点2种基因型，GG型、GC型各5例；G2385R位点3种基因型，GG型、GA型、AA型各5例。

1.4LRRK2基因R1628P、G2385R基因型检验 将SYBR Green Reanl time PCR作为技术平台，采用相对定量的方法，以人β2-微球蛋白(B2M)作为内参基因，辅以序列特异引物引导的PCR反应(PCR-SSP)，设定标准品中杂合子对应的野生碱基作为对照组，对LRRK2基因R1628P、G2385R位点基因多态性分型检验，引物序列见表1。基因分型结果：R1628P位点，引物U1对应野生碱基G，引物U2对应突变碱基C；G2385R位点，引物L1对应野生碱基G；引物L2对应突变碱基A。PCR反应体系总体积20 μl，含dd H2O 6.0 μl、SYBR®Prime Ex TaqTM (2×)10 μl、上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl、ROX 荧光染料Ⅱ(50×)0.4 μl、基因组DNA(10 ng/μl)2.0 μl。PCR反应在实时定量PCR扩增仪(ABI 7500)上进行。两步法PCR扩增标准程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，循环40次。每个待检测样品均设3个复孔，每次PCR反应均设阳性对照与阴性对照。

表1 扩增引物序列信息

2 结 果

2.1对标准品的基因型检验 标准品纯合子的相对表达量是杂合子的2倍。LRRK2-R1628P位点检测其基因型可见G/G纯合子及G/C杂合子；LRRK2-G2385R位点检测其基因型可见G/G及A/A纯合子、G/A杂合子。本实验所得基因型分型结果与已知基因型完全吻合。

2.2对待测样品的基因型检验 对标准品实现成功分型后，采用相同方法对待测样品进行检验，并用经典的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的方法验证分型结果的准确性，我们发现两种分型方法所获得的基因型分型结果完全一致。由此可见，本研究建立的LRRK2基因多态性分型方法同样可以实现准确的基因型分型。本次调查的100例PD样品中未见R1628P位点变异后形成的C/C杂合子。

3 讨 论

RT-PCR技术通过荧光信号的积累监测整个反应进程，使PCR扩增和终产物检测全部处在封闭的条件下，从而具有实时监测、检测范围宽、敏感性高、特异性好的突出优势，该方法无后续的检测步骤，有效避免了交叉污染，方便快速，同时可以进行多重检测，节省大量试验时间和成本，极大地克服了传统PCR 技术的不足。本研究针对目的基因的特定位点，设计序列特异性引物，优化包括引物量和模板量在内的反应体系及循环参数，成功建立了可检测LRRK2基因R1628P、G2385R位点的SYBR Green Real time PCR技术平台，可应用于PD相关基因LRRK2疾病易感位点的基础研究与临床诊断。本研究采用的SYBR Green是一种结合于双链DNA微槽(MGB)的染料，结合后荧光强度增加100倍。荧光信号随PCR进程与不断生成的产物呈正比，形成荧光扩增曲线，荧光强度的增加与初始模板相关，可进行靶核酸的定量检测。因此，研究中发现纯合子的起始拷贝量相当于杂合子的2倍，在序列特异性引物的引导下实现了基因型的准确分型。该方法与高度敏感及特异的Taqman探针相比，使用SYBR Green进行荧光定量引物设计较简单，成本相对较低，同样可以达到实验目的，适合在基层研究机构的高通量检测。