一氧化氮合酶调节姜黄素对非小细胞肺癌迁移和侵袭的作用及机制

陆益民 虞乐群 石 磊

(江苏大学附属昆山市第一人民医院呼吸内科，江苏 昆山 215300)

一氧化氮合酶(NOS)在多种肿瘤组织中高表达，其表达与肿瘤侵袭和迁移，肿瘤血管分化和形成关系密切〔1〕。非小细胞肺癌(NSCLC)NOS表达水平明显高于小细胞肺癌〔2〕。姜黄素为一种中药提取物，主要从中药姜黄根茎提取，具有抗炎、抗血管增生、抗肿瘤增殖等多种作用。有报道发现一定浓度的姜黄素可有效抑制NSCLC肺癌增殖〔2〕，但对NSCLC迁移和侵袭能力的作用及其机制不明确。本研究旨在探讨NOS调节姜黄素对NSCLC的迁移和侵袭的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 人NSCLC A549细胞株购自中国科学院上海细胞研究所。姜黄素购自美国Sigma生物有限公司。RPMI1640培养液和胎牛血清购自美国Gibco公司。重组人工基底膜Matrigel购自美国BD公司。3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)试剂盒购自南京碧云天生物科技公司。诱生型NOS(iNOS)，基质金属蛋白酶(MMP)-9和E-cad抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。一氧化氮(NO)Griess检测试剂盒购自Biovision公司。Transwell小室购自Corning Costar公司。购买人iNOS质粒iNOS-Pcr4-TOPO(美国Open Biosystems公司)和真核表达质粒载体pVAX(Invitrogen公司)构建pVAX-iNOS过表达载体。

1.2细胞培养 A549细胞培养于10%胎牛血清(FBS)RPMI1640培养液，置于37℃、5%CO2孵箱中，隔天更换培养基，细胞铺满培养瓶70%～80%时，用0.25%胰蛋白酶消化后传代继续培养。

1.3MTT实验检测细胞增殖能力 细胞经胰蛋白酶消化后，调整细胞浓度至1×105个/L，种植于96孔板，每孔100 μl，24 h后加无血清杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)培养液培养48 h，使细胞同步化于静止期。弃上清，加入不同浓度姜黄素(20、40、80、160 μmol/L)， 每组设6个复孔,培养72 h,弃上清，每孔加10 μl MTT和100 μl无血清DMEM培养液， 继续培养4 h,去培养液,加100 μl二甲亚砜37℃孵育10 min完全溶解， 酶标仪以测量波长490 nm测吸光度值。抑制率(%)=〔 1 -(药物组吸光度值/对照组吸光度值)〕×100%。

1.4Transwell迁移和侵袭试验 侵袭实验先使用Matrigel胶包被Transwell小室，而迁移实验无需用Matrigel胶包被Transwell小室。将处于对数生长期的A549细胞(姜黄素浓度分别为20、40、80、160 μmol/L)和含有0.1%牛血清白蛋白(BSA)的RPMI1640培养基制成浓度为5×104/ml的细胞悬液，加于上室；将含有10% FBS的RPMI1640培养基加于下室，设定3个平行孔，培养24 h后取出小室，用棉签擦去上室内的非侵袭细胞，倒置风干后，0.1%结晶紫染色、计数。

1.5Western印迹鉴定 各组细胞处理后提取总蛋白，加入上样缓冲液，12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳,结束后转膜，125 mA电流下4 ℃转膜120 min，封闭2 h，一抗(1∶200)稀释后37℃孵育1.5 h，漂洗3次，每次5 min，孵育二抗1.5 h后漂洗，用增强化学发光(ECL，Pierce公司)显影，凝胶成像仪成像。β-actin检测作为内对照。

1.6统计学方法 采用SPSS11.0进行方差分析。

2 结 果

2.1姜黄素对A549细胞增殖的影响 不同浓度姜黄素 (20、40、80、160 μmol/L)作用24～72 h后，A549细胞表现出细胞生长明显受到抑制，并且这样抑制程度与姜黄素药物浓度和作用时间呈正相关。160 μmol/L姜黄素作用A549细胞24 h可达到半数抑制率,约47.3%。见图1。

2.2姜黄素对A549细胞迁移的影响 不同浓度姜黄素 (20、40、80、160 μmol/L)作用24 h后，A549细胞穿过未包被Matrigel胶的Transwell小室计数随着药物的浓度增加，穿过细胞数逐渐减少。不同浓度姜黄素干预组间差异有统计学意义(P<0.05)。表明细胞迁移能力随着姜黄素浓度的增加而降低。见图2。

2.3姜黄素对A549细胞侵袭的影响 不同浓度姜黄素 (20、40、80、160 μmol/L)作用24 h后，A549细胞侵袭穿透Matrigel成胶人工基底膜的细胞计数也随着药物的浓度增加，穿透细胞数逐渐减少。不同浓度姜黄素干预组间差异有统计学意义(P<0.05)。表明细胞侵袭能力随着姜黄素浓度的增加而降低。见图3。

图1 不同浓度姜黄素对A549细胞生长抑制率的影响

图2 不同浓度姜黄素对A549细胞迁移的影响(×200)

图3 不同浓度姜黄素对A549细胞侵袭的影响(×200)

2.4姜黄素对A549细胞iNOS、MMP-2及MMP-9蛋白表达的影响 根据IC50，选择160 μmol/L姜黄素作用于A549细胞24 h，与对照组(1.0)相比，160 μmol/L姜黄素作用后iNOS(0.13±0.03)、MMP-2(0.23±0.07)和MMP-9表达(0.07±0.02)显著降低(P<0.05)。见图4。

图4 姜黄素对A549细胞iNOS、MMP-2及MMP-9蛋白表达的影响

2.5姜黄素对A549细胞NO生成的影响 作用24～72 h后，不同浓度姜黄素可有效抑制A549细胞生成NO的能力，并随着药物浓度增加，抑制力增强(P<0.05)。见表1。

表1 姜黄素对A549细胞产生NO能力的影响

与姜黄素0 μmol/L比较：1)P<0.05；与24 h比较：2)P<0.05

2.6过表达iNOS逆转姜黄素对A549细胞的迁移和侵袭作用 A549细胞转染pVAX-iNOS过表达载体24 h后iNOS蛋白明显升高(3.61±0.71 vs 1.00±0.30)。转染pVAX-iNOS过表达载体显著扭转姜黄素对A549细胞的迁移和侵袭作用(P<0.05)。见图5和图6。

图5 姜黄素对A549细胞的迁移和侵袭作用(×200)

图6 A549细胞转染pVAX-iNOS过表达载体后iNOS蛋白表达水平

3 讨 论

机体内NOS通过生成NO参与调节机体的多种生理过程。生成的NO参与肿瘤血管形成及肿瘤细胞的迁移和侵袭〔3〕。由此，推测NOS也可能参与调节肿瘤的侵袭和转移。Assawasuparek等〔4〕研究发现Scabraside D可通过抑制NOS表达抑制胆管癌细胞侵袭能力。体内NOS一般包括三种异构酶形式，分别为内皮型(eNOS)、神经型(nNOS)和iNOS。而iNOS与肿瘤的发生发展关系密切〔5〕。研究表明iNOS主要由肿瘤细胞和巨噬细胞在病理过程中产生。肿瘤细胞产生iNOS后，可进一步催化产生大量的NO，而NO进一步促进肿瘤血管增生和细胞侵袭和转移。

iNOS产生与肺癌关系密切〔6〕。iNOS在肺癌组织中含量要明显高于正常对照肺组织。其在肺鳞癌早期病变阶段的组织中便呈现高表达状态，随着肺鳞癌的进展，其表达水平也逐渐增高。肺癌的分化越差，iNOS表达的阳性率就越高。但有研究发现iNOS在小细胞肺癌中表达并不是十分高，而在非小细胞肺癌中呈现过表达状态。李牧等〔1〕发现过表达的iNOS与宫颈癌HeLa细胞的侵袭和转移关系密切。但iNOS与NSCLC的侵袭和转移关系至今尚未明确。

姜黄素是从植物姜黄的根茎提取的一种有效的广谱抗肿瘤成分〔7〕。本研究实验结果表明姜黄素可抑

制NSCLC细胞增殖。姜黄素可有效抑制NSCLC侵袭和迁移能力，并且与姜黄素浓度相关。姜黄素的这种抑制能力与NSCLC的iNOS表达水平有关，姜黄素可有效抑制NSCLC的iNOS表达；相反，pVAX-iNOS过表达载体上调NSCLC细胞内iNOS表达水平后，姜黄素抑制NSCLC侵袭和迁移能力明显下降。有研究表明iNOS 可调节MMPs表达水平，而后者与细胞侵袭和迁移能力关系密切〔4〕。MMP-2和9是侵袭相关蛋白，可降解细胞基底膜胶原蛋白，其高表达可显著提高恶性肿瘤的侵袭转移能力。综上，姜黄素可有效抑制NSCLC增殖，同时抑制其迁移和侵袭，其后者机制可能与iNOS相关信号通路受到抑制有关。