响应面法优化酪蛋白酸钠—豌豆分离蛋白纳米乳液制备工艺

李静红

(中国农业科技开发中心，北京　100000)

豌豆分离蛋白(Pea protein isolated，PPI)的必需氨基酸组成均衡，与FAO/WHO推荐标准模式较为接近[1-4]，但由于其功能性质与大豆蛋白相比较差，从而未在食品加工与利用中得到充分应用[5]。酪蛋白酸钠(SC)是酪蛋白的钠盐形式，具有较高的乳化性和增稠性[6]，因此，可以将SC与PPI复合，从而改善PPI的功能特性。Yerramilli等[7]通过将PPI和SC等比例混合后采用高压均质处理制成PPI-SC纳米乳液，结果发现，该纳米乳液具有较好的储藏稳定性。Ji等[8]通过将酪蛋白酸钠与大豆分离蛋白以1∶1的比例混合制备成5%的O/W乳液，结果发现，混合乳液的稳定性比单独蛋白质乳液好。超声波是一种具有空化作用的处理技术[9-11]，目前，鲜有将超声处理用于制备PPI-SC纳米乳液的研究。鉴于此，本文以PPI和SC为乳化相，通过响应面法优化超声处理制备PPI-SC纳米乳液的工艺，以获得具有较好稳定性的纳米乳液。

1　材料与方法

1.1　材料与仪器

姜黄素，美国Sigma公司；豌豆分离蛋白(PPI)，山东禹王实业有限公司；酪蛋白酸钠(SC)，澳大利亚Murray Goulburn公司；中链甘油三酯(MCT)，美国Sigma公司；其他试剂，均为国产分析纯。

Ultra-Turrax T25高速分散器，德国IKA；Zetasizer Nano-ZS90光散射粒径分析仪，英国Malvern；UV2600紫外可见分光光度计，日本岛津；Turbiscan Lab Expert浓缩体系稳定性分析仪，法国 Formulaction；JY92-2D型超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2　试验方法

1.2.1PPI-SC纳米乳液制备工艺将一定质量的PPI和SC溶于磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)中制成水相。另取一定质量的姜黄素溶于MCT中制成油相，采用磁力搅拌器搅拌直至姜黄素完全溶解，最终油相中姜黄素的浓度为1%(w/w)。将水相与油相以9∶1的比例混合，采用高速分散器在18 000r/min下处理6min得到粗乳液。取适量粗乳液置于烧杯中，采用超声波细胞破碎仪进行处理(参数见1.2.5)后得到SC-PPI纳米乳液。

1.2.2PPI-SC纳米乳液平均粒径及ζ电位测定采用Zetasizer Nano-ZS 90 光散射粒度分析仪对SC-PPI纳米乳液的平均粒径及ζ电位进行测定，油滴的折射率设置为1.45，水相溶液折射率设置为1.33。为了降低多重光散射效应，测定前将纳米乳液稀释1 000倍后测定平均粒径及PDI，稀释50倍后测定ζ电位。

1.2.3TSI分析参考Yuan等[12]的方法，利用 Turbiscan Lab Expert 浓缩体系稳定性分析仪对SC-PPI纳米乳液的稳定性进行分析。测定过程如下：取18mL PPI-SC纳米乳液于仪器专用圆柱形的玻璃杯中，55℃下扫描6 h，扫描间隔为30min，记录TSI。

1.2.4乳化产率测定参考段雪芹[13]的方法，采用HPLC测定纳米乳液中姜黄素的含量。色谱条件为：C18色谱柱(5μm，4.6mm×150mm)，流动相为乙腈—水(50%∶50%)，流速为0.9mL/min，样品进样量为10μL，检测波长为425 nm。借助Dionex Chromeleon软件处理数据，从而确定姜黄素在PPI-SC纳米乳液中的含量，并通过式(1)计算PPI-PC纳米乳液的乳化产率：

(1)

1.2.5单因素试验

(1)PPI添加量：分别配制PPI添加量为2%、3%、4%、5%、6%(w/v)、SC添加量为4%(w/v)的水相。将水相与油相以9∶1的比例混合，并用高速分散器在18 000r/min下分散6min，获得粗乳液。采用超声波细胞破碎仪将粗乳液在20KHz、输出功率400W下处理5min(超声时间4s、间隔时间4s)制得PPI-SC纳米乳液，测定其平均粒径、PDI及乳化产率。

(2)SC添加量：分别配制PPI添加量为4%(w/v)，SC添加量为3.5%、3.75%、4%、4.25%、4.5%(w/v)的水相。将水相与油相以9∶1的比例混合，并用高速分散器在18 000 r/min下分散6min，获得粗乳液。采用超声波细胞破碎仪将粗乳液在20 KHz、输出功率400W下处理5min(超声时间4 s、间隔时间4 s)制得PPI-SC纳米乳液，测定其平均粒径、PDI及乳化产率。

(3)超声功率：配制PPI添加量为4%(w/v)、SC添加量为4%(w/v)水相。将水相与油相以9∶1的比例混合，并用高速分散器在18 000r/min下分散6min，获得粗乳液。采用超声波细胞破碎仪将粗乳液在20KHz，输出功率分别为200、300、400、500、600W下处理5min(超声时间4 s、间隔时间4 s)制得PPI-SC纳米乳液，测定其平均粒径、PDI及乳化产率。

1.2.6Box-Benhnken中心组合试验设计根据单因素试验结果，选取PPI添加量(%)、SC添加量B(%)及超声功率C(W)3个因素为自变量，以平均粒径、TSI值及乳化产率为响应值，利用Design-Expert软件进行响应面分析设计优化，从而确定超声处理制备PPI-SC纳米乳液的最佳工艺(表1)。

表1　试验因素及编码

1.3　数据处理

每组试验都进行3次平行试验。采用SPSS 20对数据进行差异显著性分析，P<0.05为显著性差异；采用Design-Expert进行响应面分析设计优化实验结果。

2　结果与分析

2.1　单因素试验

2.1.1PPI添加量控制SC添加量为4%(w/v)、超声功率400W，调控PPI添加量分别为2 %、3 %、4 %、5 %、6 %(w/v)，考察PPI添加量对PPI-SC纳米乳液平均粒径、ζ电位、PDI、浊度及乳化产率的影响规律。由表2可知，PPI-SC纳米乳液的平均粒径数值随着PPI添加量的增加先下降后上升，这可能是由于当PPI添加量较低时，PPI分子间可聚集生成胶束体系，而随着PPI添加量的增加，其界面蛋白浓度达到临界值，不会再吸附更多的PPI，当PPI添加量过高时，未在连续相界面吸附的PPI分子会因渗透聚集作用而产生液滴絮凝[14]。Donsi等[15]利用添加量为4%(w/v)的豌豆分离蛋白在高压均质处理下成功制备了稳定的纳米乳液。PDI是反应乳液稳定性的重要参数，其数值越小，说明乳液颗粒分布越集中。而TSI数值越小，ζ电位绝对值越大，表明乳液越稳定。由表2中PDI、TSI和ζ电位绝对值可知，PPI添加量为4%(w/v)时，SC-PPI纳米乳液的颗粒分布集中，稳定性最好。且在此PPI添加量下，纳米乳液的平均粒径最小。由此确定，SC-PPI纳米乳液制备工艺最优的PPI添加量为4%(w/v)。

表2　PPI添加量对纳米乳液性质的影响

2.1.2SC添加量由表3可知，SC-PPI纳米乳液的平均粒径和PDI值随着SC添加量的增加而逐渐上升，当SC添加量为4%(w/v)时，达到最小值，之后逐渐增高。当SC添加量逐渐升至4%(w/v)时，SC与未完全吸附于连续相的PPI作用，进而降低因蛋白质聚集体而产生的油滴絮凝，从而使SC-PPI纳米乳液的平均粒径和PDI值下降。而随着SC添加量的增加，纳米乳液的平均粒径和PDI值逐渐下降，这有可能是由于过量的SC代替PPI进入连续相，从而降低界面蛋白含量，乳液粒径增大。而ζ电位绝对值和TSI值的变化趋势进一步验证了这一可能性。因此，为制备性质稳定的SC-PPI纳米乳液，确定其SC添加量为4%。

表3　SC添加量对纳米乳液性质的影响

表4　超声功率对纳米乳液性质的影响

2.2　响应面法分析

以PPI添加量A(%)、SC添加量B(%)、超声功率C(W)，以PPI-SC纳米乳液的平均粒径R1(nm)、PDI R2及乳化产率R3(%)为响应值进行响应面试验(表5)。

表5　响应面试验设计及结果

2.2.1PPI-SC纳米乳液平均粒径响应面分析平均粒径R1通过软件Design-Expert进行数据分析，建立二次响应面回归模型如式(2)：

R1=149.82-6.45A-14.06B-10.89C-7.28AB+6.93AC-9.40BC+34.87A2+41.59B2+30.74C2

(2)

式(2)中：R1为平均粒径；A为PPI添加量；B为SC添加量；C为超声功率(图1)。

表6　SC-PPI纳米乳液平均粒径回归与方差分析结果

2.2.2PPI-SC纳米乳液TSI响应面分析TSI R2通过软件Design-Expert进行数据分析，建立二次响应面回归模型如式(3)：

R2=3.01-0.024A-0.032B-0.081C-0.015AB-0.073AC-0.045BC+0.14A2+0.082B2+0.19C2

(3)

式(3)中：R2为TSI；A为PPI添加量；B为SC添加量；C为超声功率(图2)。

表7　SC-PPI纳米乳液TSI回归与方差分析结果

图1　两因素交互作用对SC-PPI纳米乳液平均粒径的响应面

图2　两因素交互作用对SC-PPI纳米乳液TSI的响应面

图3　两因素交互作用对SC-PPI纳米乳液乳化产率的响应面

2.2.3PPI-SC纳米乳液乳化产率响应面分析乳化产率 R3通过软件Design-Expert进行数据分析，建立二次响应面回归模型如式(4)：

R3=91.28+0.19A+0.71B+0.30C+0.37AB-0.74AC+0.59BC-1.81A2-1.75B2-1.53C2

(4)

式(4)中：R3为乳化产率；A为PPI添加量；B为SC添加量；C为超声功率(图3)。

表8　SC-PPI纳米乳液乳化产率回归与方差分析结果

2.2.4联合求解采用Design-Expert 的联合求解法确定平均粒径、TSI及乳化产率均优条件为PPI添加量4.09%(w/v)、SC添加量4.06%(w/v)、超声功率419.54W，此条件下平均粒径为147.08 nm、TSI为2.99、乳化产率为91.37 %。为适应生产，将制备条件优化为PPI添加量4.00%(w/v)、SC添加量4.00%(w/v)、超声功率400 W，进行3次平行实验得到PPI-SC纳米乳液平均粒径为149.82 nm、TSI为3.008、乳化产率为91.28%。说明响应值的实验值与回归方程预测值吻合良好。

3　结论

在单因素试验基础上，利用响应面分析法优化PPI-SC纳米乳液制备工艺，拟合PPI添加量、SC添加量和超声功率3个因素，经平均粒径、TSI和乳化产率的响应面联合求解分析确定超声处理制备PPI-SC纳米乳液的工艺条件为PPI添加量4.09%(w/v)、SC添加量4.06%(w/v)、超声功率419.54W。考虑到实际操作的可行性，将制备工艺调整为PPI添加量4.00%(w/v)、SC添加量4.00%(w/v)、超声功率400W，进行3次平行试验，3次平行验证得到酪蛋白酸钠—豌豆蛋白纳米乳液平均粒径为149.82nm、TSI为3.008、乳化产率为91.28%，进一步验证本文的最佳制备工艺条件。◇