酶解—高压均质制备高溶解性、高消化率豆乳粉工艺

寻崇荣，范志军，王冬梅，王中江，江连洲，李　杨

(1 东北农业大学食品学院，哈尔滨　150030；2 黑龙江省北大荒绿色健康食品有限责任公司，哈尔滨　150036)

高压均质技术被广泛的应用于食品工程中。高压均质过程同时涉及空化、剪切、湍流和温升等问题。研究表明，高压均质会影响蛋白质的三级和四级结构，但对大多数的球状蛋白质的二级结构影响较小[12]，可与蛋白互补，限制性酶解可在一定程度上改变蛋白的二级结构[13]及功能特性，如溶解性和乳化能力[14-16]。而有研究表明，高压均质辅助碱性蛋白酶限制性酶解处理大豆球蛋白，可改善其功能特性[17]，此外，高压均质辅助胃蛋白酶酶解大豆分离蛋白，可得到更多的柔性蛋白及可溶性蛋白聚集体，提高大豆分离蛋白的溶解性、乳化性等功能特性[18]。

目前，已有研究报道了单独采用酶解法或高压均质法提高豆乳粉的溶解性，然而采用酶解联合高压均质提高豆乳粉溶解性的研究尚未见报道。本文以传统湿法加工技术制备豆乳粉为基础，利用酶解—高压均质法以改善豆乳粉的溶解性，通过响应面优化分析法对酶解—高压均质工艺进行优化，以改善豆乳粉的溶解性；对豆粉的粒径及显微结构进行分析，为速溶性豆乳粉的生产加工提供科学依据。

1　材料与方法

1.1　材料

大豆，哈尔滨九三油脂集团；大豆磷脂，周口慧洋饲料有限公司；Protex-6L碱性蛋白酶(酶活力1.0×105U/g)，丹麦novo公司；实验所需基础试剂均为分析纯，北京化学试剂公司。

1.2　仪器

FDM-Z80豆浆机，上海伟业仪器厂；FPG12800E.N00实验型高压均质机，岛津公司；喷雾干燥机，无锡昂益达机；Zetasizer Nano-ZS90光散射粒径分析仪，英国Malvern公司；AL204型分析天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；pHS-25型酸度计，上海江仪仪器有限公司；电热恒温水浴锅，余姚市东方电工仪器厂；XW-80A旋涡混合器，上海青浦沪西仪器厂；HYP-Ⅱ八孔消化炉，上海纤检仪器有限公司；LNK-871型凯氏定氮快速自动蒸馏器，江苏省宜兴市科教仪器研究所；Olympus U182/U1S光学显微镜，Copyright 奥林巴斯有限公司。

1.3　豆乳粉的制备

大豆→浸泡→热烫→磨浆→浆渣混合物→浆渣分离→豆乳→酶解→灭酶→高压均质→调配→浓缩→喷雾干燥→豆乳粉。参照齐宝坤等[3]的方法称取50g大豆于烧杯中，用浓度为0.5%的NaHCO3水溶液浸泡10 h左右后用沸水热烫5min，按豆水比1∶7的比例添加90℃的去离子水进行磨浆得浆渣混合物，然后浆渣分离得豆乳，调节豆乳温度，用0.1mol/L的HCL和NaOH调节pH，加入Protex-6L碱性蛋白酶进行酶解，酶解后95℃灭酶5min，对酶解后的豆乳进行高压均质处理后，添加2%的乳化剂大豆磷脂进行调配混匀，将调配好的豆乳进行真空浓缩至豆乳固形物含量达15%左右，然后在进口温度为185℃、出口温度为85℃条件下进行喷雾干燥即得豆乳粉。

1.4　酶解工艺的单因素试验

保持均质压力为150 MPa、均质次数2次、酶解温度为54℃、酶解时间为1.5 h、酶解pH为9、酶添加量为1.5%为基础工艺，分别选取酶解温度为45、50、55、60、65℃，酶解时间为0.5、1、1.5、2、2.5 h，酶解pH为7、8、9、10、11，酶添加量为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%进行单因素试验。通过蛋白质分散指数(%)和蛋白质消化率(%)比较分析确定酶解工艺单因素最优条件。

1.5　高压均质工艺的单因素试验

保持酶解温度为54℃、酶解时间为1.5 h、酶解pH为9、酶添加量为1.5%、均质压力为150 MPa、均质次数2次为基础工艺。在其他条件不变的情况下，分别选取均质压力为50、100、150、200、250 MPa，均质次数为1、2、3、4、5次，进行单因素试验。通过蛋白质分散指数(%)和蛋白质消化率(%)比较分析确定高压均质处理工艺单因素最优条件。

1.6　蛋白质分散指数的测定

参照齐宝坤等[3]的方法取一定量豆乳粉样品以1∶20的料液比分散于去离子水中，充分搅拌30min，待分层后将溶解液于3 000r/min下离心10min，离心后取上清液测定蛋白含量(凯氏定氮法)。计算公式如式(1)：

(1)

1.7　体外模拟胃肠道消化试验

参照夏明敬[5]的方法，称取2g豆粉溶于100mL去离子水中，在37℃的浴锅中预热10min。用1mol/L的HCl调节pH为3.0，加入50U/g的胃蛋白酶和75U/g的凝乳酶不断搅拌水解1h后用1mol/L的NaOH调节pH为7.0。然后加入1 000U/g的胰蛋白酶，不断搅拌2h，到时间后经沸水浴灭活5min。取10mL消化好的样品，加入等体积的10%的三氯乙酸沉淀蛋白，然后在4 000r/min条件下离心10min。取上清液，釆用凯氏定氮法测定可溶性蛋白的含量。蛋白质白化率计算公式如式(2)：

(2)

1.8　豆粉乳液的粒径分布

用Zetasizer Nano-ZS 90光散射粒度分析仪分别测定传统湿法制备、最佳酶解及最佳酶解—高压均质工艺制备的豆粉乳液的粒径分布规律，样品折射率设置为1.5，溶液折射率设置为1.33。为了降低多重光散射效应，分析前用去离子水稀释豆乳粉5 000倍测粒径。

1.9　豆乳粉的光学显微镜观察

通过光学显微镜分别对传统湿法工艺、最佳酶解工艺、最佳高压均质工艺及最佳酶解—高压均质工艺喷雾干燥后的豆乳粉进行观察。分别用去离子水将上述豆乳粉稀释10倍后，经旋涡混合器震荡10s，吸取混合后的豆粉乳液于载玻片上，盖上载玻片后进行显微镜观察。

1.10　数据处理

每组试验都进行3次平行试验，并进行误差分析。采用SPASS 18对实验数据进行方差分析、相关性和差异显著性分析；采用Origin 8.5软件进行作图；采用Design-Expert软件进行响应面数据分析及方差分析。

2　结果与分析

2.1　酶解工艺单因素试验

2.1.1酶解温度对蛋白质分散指数和蛋白质消化率的影响由图1可知，当酶解温度从45℃升高到55℃时，豆粉蛋白质分散指数和蛋白质消化率随温度的升高而显著增加(P<0.05)，酶解温度为55℃时，蛋白质分散指数和蛋白质消化率达到最大；继续升高酶解温度，蛋白质分散指数和蛋白质消化率均有降低趋势。该结果与齐宝坤等[3]、田杰等[24]的研究结果一致，即酶解可提高大豆分离蛋白的蛋白质分散指数和体外消化率，但温度低于或高于最适酶解温度时会降低蛋白质分散指数和蛋白质消化率。原因是Protex-6L碱性蛋白酶的最适酶解温度在55℃左右，在该酶解温度范围内酶解效果较好，当低于或高于该温度时会降低Protex-6L碱性蛋白酶的催化活性，降低蛋白质分散指数和蛋白质消化率。说明适度的酶解利于人体吸收利用，改善豆乳粉的营养价值。综合考虑，选择酶解温度为55℃。

2.1.2酶解时间对蛋白质分散指数和蛋白质消化率的影响由图2可知，当酶解时间由0.5h增加到1.5h时，蛋白质分散指数和蛋白质消化率随着酶解时间的增加而显著性增加(P<0.05)，而超过1.5h后继续增加酶解时间，蛋白质分散指数和蛋白质消化率变化不明显。原因是酶解初期底物相对含量较高，酶与底物接触充分，利于酶促反应的进行，提高豆乳粉的蛋白质分散指数和蛋白质消化率；但随着酶解时间的继续延长，底物相对含量不断减少，产物相对含量增加，酶解产物与底物产生竞争性抑制，酶促反应达到平衡，导致蛋白质分散指数和蛋白质消化率变化不明显[22，24]。综合考虑，选择酶解时间为1.5 h。

2.1.3酶解pH对蛋白质分散指数和蛋白质消化率的影响由图3可知，当酶解pH从7.0升高到9.0时，豆粉蛋白质分散指数和蛋白质消化率随温度的升高而显著增加(P<0.05)，酶解pH为9.0时，蛋白质分散指数和蛋白质消化率达到最大；继续升高酶解pH，蛋白质分散指数和蛋白质消化率均有降低趋势。原因是Protex-6L碱性蛋白酶的最适酶解pH在9.0左右，在该酶解pH时酶解效果较好，当低于或高于该pH时会改变酶分子构象，降低Protex-6L碱性蛋白酶的催化活性，抑制酶促反应，从而降低蛋白质分散指数和蛋白质消化率[15，24]。综合考虑，选择酶解pH为9。

2.1.4酶添加量对蛋白质分散指数和蛋白质消化率的影响由图4可知，当酶添加量从0.5%升高到1.5%时，豆粉蛋白质分散指数和蛋白质消化率随着酶添加量的增加而显著增加(P<0.05)，当加酶量达到1.5%时，蛋白质分散指数和蛋白质消化率达到最大；继续增加酶添加量，蛋白质分散指数和蛋白质消化率有下降趋势。原因是相对底物含量的限制及酶分子之间相互碰撞减少了底物与酶碰撞机会，降低酶促效应，导致蛋白质分散指数和蛋白质消化率下降，这与徐锦丽[23]的研究结果一致，即适度增加酶添加量可改善大豆蛋白的溶解性及消化利用率。综合考虑，确定酶添加量为1.5%。

图1　酶解温度对蛋白质分散指数和蛋白质消化率的影响

图2　酶解时间对蛋白质分散指数和蛋白质消化率的影响

图3　酶解pH对蛋白质分散指数和蛋白质消化率的影响

图4　酶添加量对蛋白质分散指数和蛋白质消化率的影响

2.2　高压均质工艺单因素确定试验

由图5可知，当均质压力从50MPa升高到150MPa时，豆粉蛋白质分散指数和蛋白消化率随着均质压力的增加而显著增加(P<0.05)。这是由于豆乳中的蛋白、油滴等相互聚集的大颗粒在高压均质的高速剪切作用下均匀分散，降低大分子之间的缠绕作用，使豆乳的表观黏度下降，促进蛋白质的水化作用，使其溶解度增大[20]。而在高压均质的高速剪切作用下大豆蛋白的刚性结构逐渐展开，柔性增加，暴露出更多的极性基团和疏水基团，蛋白质颗粒的表面电荷分布加强，也提高了蛋白质的水化作用及乳化作用，以致蛋白质分散指数提高，豆粉粒径可能减小，促进蛋白的消化吸收[20]。综合考虑，选择均质压力为150MPa。

由图6可知，当均质次数对豆粉蛋白质分散指数及蛋白消化率的影响不显著时(P>0.05)，说明增加均质次数对豆粉的品质影响不大。综合考虑蛋白质分散指数、表观粘度的变化及加工成本，选择均质次数为2次。

2.3　豆粉乳液粒径的对比分析

由图7可知，与传统湿法工艺相比，经酶解及酶解—高压均质工艺制备的豆粉乳液粒径减小且经酶解—高压均质工艺制备的豆粉乳液只有1个单峰，粒径最小，粒径分布范围最窄。原因可能是酶解使蛋白降解为小分子肽，暴露出更多的疏水基团，蛋白分子由球状刚性结构伸展为柔性结构，提高了蛋白的界面活性，降低油水界面的张力，在乳化过程中形成粒径细小的乳液滴，经喷雾干燥得到较小粒径的豆乳粉，豆粉乳液粒径减小；而高压均质的强剪切力、撞击、空穴效应可进一步改善蛋白的表面疏水性、界面活性及乳化性，使酶解后的豆粉乳液更加分散，粒径减小、分布均一[21，25]。而粒径对豆粉的溶解性和豆粉乳液的表观粘度有重要影响。由斯托克斯定律知，液滴移动速度与其半径平方成正比，因此豆粉乳液的溶解性及表观粘度可能与液滴粒径有关，粒径越小，豆粉乳液的溶解性越强[26-27]。

2.4　豆粉溶液的显微观察

由图8可知，传统湿法工艺制备的豆乳粉经溶解混合后，显微图像显示出部分乳液液滴聚集，豆乳颗粒分布不均匀；相比较传统湿法工艺，经酶解工艺制备的豆粉乳液液滴聚集较少，豆乳颗粒分布较均匀，粒径较小；而酶解—高压均质工艺制备的豆粉乳液粒径最小，豆乳颗粒均匀分布且没有乳液液滴聚集现象。进一步说明酶解可改善豆乳粉的溶解性，而高压均质处理对酶解有辅助效果，可提高蛋白的乳化性及表面活性以进一步提高豆乳粉的溶解性及分散性。

图5　均质压力对蛋白质分散指数和蛋白消化率的影响

图6　均质次数对蛋白质分散指数和蛋白消化率的影响

图7　不同豆粉乳液的粒径分布

图8　100倍物镜下不同豆乳粉溶液的显微图像

3　结论

本文对高压均质辅助酶解制备高溶解性豆乳粉工艺进行研究，分别采用离心法、体外模拟胃肠道消化、光散射粒度分析仪及光学显微镜测定豆乳粉的蛋白质分散指数、蛋白质消化率，分析豆粉粒径分布及显微观察。单因素试验表明，均质压力、均质次数、酶解温度、酶解时间、酶解pH、酶添加量对豆乳粉蛋白质分散指数具有显著影响。与未经均质及酶解处理的传统豆乳粉(蛋白质分散指数为79.16%[3])相比，高压均质辅助酶解工艺显著提高了豆乳粉的溶解性及蛋白质消化率，减小了豆粉平均粒径，其蛋白质分散指数提高了近14%。◇