羊乳乳清蛋白组成和功能及其与人乳、牛乳的对比分析

张熙桐，李墨翰，吴尚，吴尚仪，韩宏娇，孔繁华，岳喜庆

（沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳 110866）

羊乳是由健康乳羊分泌的脂肪含量高于2.5%、非脂乳固体含量高于7.5%的正常乳汁(不包括初乳)。羊乳中富含蛋白质、脂肪、氨基酸、矿物质以及多种维生素，其基础结构和各项营养元素配比均与人乳相类似，有“白色血液”之称。羊乳独特的营养价值和风味，已成为西方发达国家日常生活的必须消费品，并使用羊乳配方奶粉替代母乳，羊乳市场占有率高达80%[1,2]。羊乳和牛乳一样富含营养成分和生物活性物质[3]，与牛乳相比，羊乳具有蛋白质凝块软且小、易消化吸收、乳糖不耐症发生率低、与人乳更接近等优点[4]。

乳清蛋白是乳在适当的温度及等电点的情况下，经过酸化沉淀以后分离出来的物质[5]。乳清蛋白必需氨基酸种类齐全，组成模式与人体相似，容易消化吸收，具有极高的生物利用效价；乳清蛋白功能多样，来源于天然食品，是可获得的最经济的食物蛋白质资源之一[6～8]。可以补充人体所需要的氨基酸，提高机体抗氧化能力，保护免疫细胞减轻疲劳[9]。近年来，国内外对乳清蛋白的组成及功能的研究多集中在人乳与牛乳，对羊乳乳清蛋白组成及功能的研究甚少，且多集中于单一种类乳的分析，很少进行多种乳的横向对比。

本研究将人乳、牛乳及羊乳中的乳清蛋白进行分离，经过酶解后进行质谱鉴定，将鉴定后的结果通过基因本体（gene ontolpgy，GO）功能注释以及京都基因与基因组百科全书系统（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）代谢通路分析，在重点研究羊乳的基础上，深入探究羊乳与人乳、牛乳乳清蛋白的组成及功能的区别，以期为羊乳的进一步研究和开发提供了一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛乳、羊乳：均采集自沈阳农业大学畜牧场。

采集 30份健康奶牛、奶羊的乳汁低温运回实验室，并在实验前进行混合（防止个体差异）。除当天用乳样放入4 ℃冰箱保存外，其余乳样均置于-80 ℃冰柜冷藏。

人乳：采集某医院正常生产、身体健康、头胎、饮食正常的30位授乳母亲的乳汁低温运回实验室，并在实验前进行混合（防止个体差异）。除当天用乳样放入4 ℃冰箱保存外，其余乳样均置于-80 ℃冰柜冷藏。由授乳母亲自愿提供。

1.2 仪器与设备

CR-21G高速冷冻离心机，日本日立公司；真空冷冻干燥机，上海比朗仪器制造有限公司；毛细管高效液相色谱，美国Agilent公司；Q-Exactive质谱仪，赛默飞世尔科技公司。

1.3 实验方法

1.3.1 乳清蛋白的提取[10,11]

取人乳、牛乳、羊乳各50 mL，在4 ℃，6000 r/min下离心20 min，去除乳脂层，再置于15000 r/min下离心60 min，获得乳清部分，除去酪蛋白，置入真空冷冻干燥机制得冻干粉。

1.3.2 FASP酶解[12,13]

量取三种样品各20 μL，倒入等量的DTT中，得到浓度为100 mM的混合液，在开水中加热5 min，然后转移到常温环境下，添加 20 μL UA buffer（8 M Urea，150 mM TrisHCl pH 8.0）达到均匀状态后，转移到10 ku超滤离心管中，离心14000 r/min 15 min。添加200 μL UA buffer离心14000 r/min 15 min，倒掉滤液。添加 100 μL IAA（50 mM IAA in UA），600 r/min振荡1 min，在无光室温环境下静置30 min，离心14000 r/min 10 min。添加100 μL UA buffer，离心 14000 r/min 10 min 2次。添加100 μL (NH4)2CO3buffer，离心14000 r/min、10 min 2 次。添加 40 μL Trypsin buffer（4 μg Trypsin in 40 μL (NH4)2CO3buffer），600 r/min 混合 1 min，37 ℃ 16～18 h。倒入新收集管中，离心 14000 r/min 10 min，单独放置滤液。

1.3.3 毛细管高效液相色谱[14,15]

通过纳升流速HPLC液相系统Easy nLC予以分离。缓冲液：A液为0.1%甲酸水溶液，B液为0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈为84%）。色谱柱通过95%的A液平衡。样品由自动进样器上样到上样柱 Thermo scientific EASY column(2 cm×100 μm 5 μm-C18)，然后通过分析柱Thermo scientific EASY column(75 μm×100 mm 3 μm-C18)分离，流速为250 nL/min。液相梯度为：0～50 min，B液线性梯度从0%到50%；50～54 min，B液线性梯度从50%到100%；54～60 min，B液保持100%不变。

1.3.4 ESI质谱鉴定[16,17]

样品经毛细管高效液相色谱分离后用 Q-Exactive质谱仪（Thermo Finnigan）进行质谱分析。分析时长：60 min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：300～1800m/z，一级质谱分辨率：70,000 atm/z200，AGC target：3e6，一级 Maximum IT：10 ms，Number of scan ranges：1，Dynamic exclusion：15.0 s。多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描（full scan）后采集10个碎片图谱（MS2 scan），MS2 Activation Type: HCD，Isolation window：2m/z，二级质谱分辨率：17,500 atm/z200，Microscans：1，二级 Maximum IT：60 ms，Normalizedcollision energy：27 eV，Underfill ratio：0.1%。

1.3.5 ESI质谱数据分析[18]

利用 MaxQuant软件对原始文件展开数据库检索。具体参数为：enzyme为Trypsin；missed cleavage设为2；静态修饰选择Carbamidomethy C；动态修饰选择Oxidation M、Acetyl (Protein N-term)。Peptides FDR＜0.01，Protein FDR＜0.01。

1.3.6 GO功能分析及 KEGG代谢通路分析[19～21]

以上实验操作进行三次重复，对于鉴定到的蛋白，选取其中被鉴定到两次及以上的蛋白进行分析。GO数据库提供生物过程、分子功能和细胞组成三大类功能信息。通过DAVID Bioinformatics Resources在线工具展开数据库查询及检索，获取 GO功能信息和KEGG代谢通路结果。

2 结果与讨论

2.1 人乳、牛乳、羊乳蛋白酶解后的鉴定结果分析

图1 羊乳、牛乳、人乳中乳清蛋白组成Fig.1 Composition of whey proteins in goat milk、bovine milk and human milk

由图1所示，测得羊乳乳清蛋白中共含有156种蛋白，少于牛乳的278种蛋白及人乳的454种蛋白，其中牛乳与人乳乳清蛋白蛋白质种类与杨梅等[22]的数据，人乳460种、牛乳284种较为接近。这主要是由两方面原因造成的：一方面是由于人乳营养更为丰富，蛋白种类较牛乳、羊乳更多；另一方面是由于羊乳和牛乳，尤其是羊乳的数据库不够完善。从数据中可以看出，羊乳和牛乳乳清蛋白种类数量上有所欠缺，无法完全代替人乳在婴幼儿生长发育阶段的作用。

2.2 人乳、牛乳、羊乳乳清蛋白的组成分析

由图2可知，羊乳中含有99种特异性表达蛋白质，牛乳中有152种特异性表达蛋白质，人乳中含有344种特异性表达蛋白质。这说明羊乳与牛乳、人乳的乳清蛋白在蛋白质组成上还存在较大差异。但有31种蛋白质在羊乳与牛乳乳清蛋白中均有表达，15种蛋白质在羊乳与人乳乳清蛋白中均有表达，说明羊乳能够在部分种类的蛋白质上代替牛乳及人乳。因此，对羊乳的蛋白质组成分析，能够为日后生产婴幼儿食品及功能性食品提供新的来源，同时也能为羊乳的进一步研究和开发提供了一定的理论参考。

图2 羊乳、牛乳、人乳中乳清蛋白种类的维恩图Fig.2 Venn diagram of whey protein species in goat milk,bovine milk and human milk

2.3 人乳、牛乳、羊乳乳清蛋白GO功能分析

2.3.1 人乳、牛乳、羊乳乳清蛋白参与的生物过程分析

图3 羊乳、牛乳、人乳中乳清蛋白参与的生物过程Fig.3 Biological process of whey protein in goat milk, bovine milk and human milk

对三种乳的乳清蛋白蛋白进行数据库检索，选择主要的生物过程（如图3）。三种乳乳清蛋白的生物过程主要是免疫系统过程、定位作用、应激反应、多生物过程、生物粘附和生物调节等。通过对三种乳乳清蛋白参与生物过程的分析可知，三种乳乳清蛋白在生物调节过程中发挥的作用最高，其次是对刺激的反应，其中人乳在参与各项生物过程的乳清蛋白种类数明显高于牛乳与羊乳，而羊乳与牛乳差异不明显。生物调节包括，神经调节、体液调节、反馈调节、分级调节等，是人体所需要的重要生物过程，对婴幼儿的生长发育起到关键作用。应激反应也极其重要，婴儿离开母体体内环境，接触外界不同的环境，这种环境转变，需要婴儿机体具有良好的应激反应能力，这样才可以让婴儿尽早地适应外界环境变化，维持机体健康生长。羊乳乳清蛋白在以上几个生物过程中都有参与，且参与的蛋白质种类数与牛乳相近，表明羊乳可以与牛乳作为婴幼儿功能性食品来源，但不能完全替代人乳。

2.3.2 人乳、牛乳、羊乳乳清蛋白参与的分子功能分析

图4 羊乳、牛乳、人乳中乳清蛋白具有的分子功能Fig.4 Molecular function of whey protein in goat milk, bovine milk and human milk

通过GO功能注释中的分子功能分析（如图4），可知三种乳乳清蛋白主要具有的分子功能为调节作用、结合作用、抗氧化活性和酶调节活性等。其中，羊乳乳清蛋白在抗氧化活性、酶调节活性以及调节作用上与人乳、牛乳的乳清蛋白相接近，但在结合作用上与人乳具有较大差异。通过数据库分析可知，三种乳乳清蛋白的结合作用主要体现在蛋白质结合、碳水化合物结合、抗原结合和离子结合等，这些都对婴幼儿的成长发育起到重要作用。例如，蛋白质的结合作用可以将其他物质与蛋白质相结合，形成结合蛋白，以此扩展蛋白质功能；碳水化合物衍生物结合作用影响着婴幼儿对碳水化合物及其衍生物的吸收和利用；抗原结合能够起到激活补体，促进吞噬的作用等[23]。羊乳在以上几个结合功能中都有良好表现，该数据也为羊乳的进一步开发和研究，提供了一定的理论参考依据。

2.3.3 人乳、牛乳、羊乳乳清蛋白的细胞组成分析

图5 羊乳、牛乳、人乳中乳清蛋白参与的细胞组成Fig.5 Composition of cells involved for whey protein in goat milk, bovine milk and human milk

由图5可知，三种乳乳清蛋白参与形成的细胞组成有胞外区、血的微粒、胞囊、细胞器以及内膜系统等。其中主要是胞外区及细胞器区。胞外区是许多细胞表面功能分子的特异结构区，在此区域发生很多细胞激活反应，是分子发挥结合功能的重要区域。细胞器包含，线粒体、内质网、高尔基体和核糖体等细胞器，对婴幼儿生长发育起重要作用[24]。羊乳乳清蛋白虽然较人乳乳清蛋白在参与细胞组成功能上有较大差距，但其能够参与大多对人体有益的细胞组成功能，且不逊与牛乳乳清蛋白，因此羊乳乳清蛋白能够一定程度上代替牛乳在婴幼儿生长发育过程中发挥关键作用。

2.4 KEGG通路分析

图6 羊乳乳清蛋白吞噬功能KEGG通路Fig.6 Phagocytosis KEGG pathway of whey protein in goat milk

如表1所示，羊乳、牛乳、人乳乳清蛋白分别参与13种、12种以及24种KEGG通路，其中三种乳共有的通路有5种，人乳与牛乳共有的通路有3种，人乳与羊乳共有通路有3种。在5种三者共有的通路中，补体和凝血级联反应以及吞噬作用，作为人体固有免疫系统反应，对婴幼儿具有重要作用。以吞噬作用为例，人体吞噬作用主要依靠吞噬细胞和中性粒细胞等的协同作用，以及起辅助作用的补体系统[25]。羊乳乳清蛋白中，蛋白质名为补体C3（loc443475）、类补体 C3 (LOC101103133)以及类补体 C3(LOC101113831)等的蛋白，能够对补体受体CR3等造成积极影响（如图6），从而间接促进婴幼儿免疫能力的提高。另外，从表1中可以看出，羊乳乳清蛋白虽然和牛乳乳清蛋白一样，与人乳乳清蛋白有多种共有通路，但还有许多人乳乳清蛋白特有的通路，如半乳糖代谢、丙酮酸代谢等是羊乳乳清蛋白无法代替的。综上可知，羊乳可以作为婴幼儿功能性食品的来源之一，但无法完全替代人乳。

表1 羊乳、牛乳、人乳中乳清蛋白参与KEGG通路种类数表Table 1 Number of KEGG pathway in whey protein in goat milk, bovine milk and human milk

3 结论

3.1 利用液质联用，从羊乳中鉴定出156种蛋白。从GO功能注释分析中可以看出，羊乳乳清蛋白在生物过程中主要参与生物调节过程；在分子功能上主要发挥结合作用；在细胞组成上主要参与胞外区和细胞器区的组成。主要参与的KEGG通路为补体和凝血级联反应以及吞噬作用，能够对免疫系统的补体系统产生积极影响。

3.2 通过对羊乳乳清蛋白的 GO功能注释及 KEGG通路的分析可知，羊乳乳清蛋白在生物过程、分子功能、细胞组成上发挥重要的功能，可以一定程度上对婴幼儿发挥生长发育起作用，能够作为婴幼儿食品的良好替代品。