HOXA3基因对口腔癌细胞增殖及侵袭能力的影响

方盛华 柳子川 邓旭斌

广州医科大学附属肿瘤医院1内一科，2内二科（广州510095）

口腔癌是发生在口腔的恶性肿瘤的总称，它是头颈部较常见的恶性肿瘤之一［1］。口腔癌主要起源于口腔上皮细胞的恶性病变，约80%属于鳞状上皮细胞癌［2］。口腔癌发病隐蔽，早期缺乏特异性的临床表现。大部分患者确诊口腔癌时，多为疾病的中晚期状态。因此，发掘可早期诊断口腔癌的分子标记物，并发现口腔癌新的治疗靶标，为临床亟待解决的问题。癌基因的激活通常导致口腔癌的发生、进展以及远处转移。针对癌基因的特异性治疗，可能为口腔癌的治疗开发新靶点打下初步的理论基础［3］。

HOXA3是近来发现的一个促癌基因。研究发现：HOXA3可以促进细胞生长，以及肿瘤细胞的侵袭以及转移［4］。关于HOXA3在肿瘤中的研究目前较少，在口腔癌中尚未见相关报道。本研究拟探讨HOXA3在口腔癌中的表达情况，并敲除HOXA3表达，在细胞功能以及机制上研究HOXA3对口腔癌细胞生长及侵袭能力的影响。

本研究明确HOXA3基因在口腔癌中的表达情况，以及致病作用，为口腔癌的治疗开发新靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 口腔癌细胞购自上海中科院。细胞使用PRMI⁃1640（含10%胎牛血清），放置于含5%CO2的37℃的培养箱中培养。

1.2 实时荧光定量PCR（qRT⁃PCR），蛋白质印迹法（Western Blot）试验 使用TRIzol试剂（Invitrogen公司）提取口腔癌细胞RNA。实时荧光定量PCR的试剂盒（qSYBR⁃green⁃containing PCR kit）购自Takara。

使用Lysis buffer提取细胞蛋白质，95℃水浴锅使蛋白质变性。使用蛋白质印迹法检测相关蛋白在细胞中的表达水平。cyclinD1，c⁃myc，CDK4以及GAPDH抗体购自santa cruz公司。MMP⁃1、MMP⁃2、MMP⁃9购自abcam公司。二抗购自中杉金桥。ECL显色发光试剂盒购自康维世纪。

1.3 细胞凋亡试验 检测细胞凋亡试剂盒（FITC⁃PI双染色）购自碧云天公司。细胞染色后，使用流式细胞仪检测相关凋亡情况。

1.4 构建低表达HOXA3基因的口腔癌细胞 根据HOXA3基因序列，设计合成已证实能稳定沉默HOXA3基因的片段（sh⁃HOXA3）。将sh⁃HOXA3基因片段构建到慢病毒载体（pLK0.1）中。包装慢病毒，使用慢病毒上清感染scc⁃9细胞。根据绿色荧光蛋白（GFP）筛选出稳定感染的细胞。Western blot验证敲除HOXA3效率。

1.5 Boyden以及划痕实验 Boyden实验步骤：消化好口腔癌细胞SCC⁃9，用不含血清的培养基重悬，置于boyden小室，小室放在12孔板。小室外使用含10%血清的培养基做诱导剂。24 h后，取出小室，计算穿透小室膜的细胞数目。

划痕实验步骤：细胞长至完全汇合后，使用无菌枪头在培养皿中央划痕。24 h后，观察不同处理组之间细胞愈合的差异。

1.6 裸鼠皮下成瘤实验 将裸鼠随机分成4组，每组5只。将1×106个细胞接种于裸鼠皮下，接种后5天，按以下方式处理：第1组为空白对照组（sh⁃ctrl），第 2组为敲除 HOXA3组（sh⁃HOXA3）。肿瘤体积每3天监测1次。肿瘤体积使用V=π/6（高度×长度×宽度）公式计算。

1.7 统计学方法 使用SPSS 13.0软件进行统计学分析。两组之间数据的差异使用两样本t检验。多组别之间的差异使用方差分析。P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HOXA3在口腔癌组织中表达水平上调 首先，笔者使用GEO数据库中的芯片（编号：GSE74530）分析口腔癌组织以及癌旁组织中表达差异的基因。从表达差异最明显的10个分子中（图1），笔者挑选HOXA3做进一步研究。分析结果提示：与癌旁组织相比，口腔癌组织中HOXA3表达上调（图1A）。笔者接着使用RT⁃PCR分析HOXA3在27列口腔癌及癌旁组织中表达水平的差异。结果与GSE74530芯片结果类似，口腔癌组织中HOXA3表达水平较癌旁组织显著上调（图1B）。Western blot以及免疫组化结果也进一步验证，HOXA3蛋白在口腔癌组织中较癌旁组织中表达上调（图1C，D）。

图1 HOXA3在口腔癌组织中表达水平Fig.1 Expression of HOXA3 in oral cancer tissue

2.2 敲除HOXA3后可以抑制口腔癌细胞生长及促进凋亡 前面的研究发现HOXA3在口腔癌组织中表达显著上升，提示HOXA3可能是潜在的癌基因。因此，我们使用慢病毒干扰片段下调口腔癌细胞株中HOXA3的表达，研究口腔癌细胞生长及侵袭能力的变化情况。

笔者挑选SCC⁃9口腔癌细胞株做功能相关实验。首先，我们使用慢病毒感染SCC⁃9细胞，建立低表达HOXA3蛋白的细胞株（图2A）。平板克隆试验发现：敲除HOXA3蛋白后，SCC⁃9细胞形成克隆的数目和大小较空白对照组明显减弱（图2B）。MTT试验发现：敲除HOXA3蛋白后，细胞生长的速度明显减慢（图2C）。Western blot实验提示：敲除HOXA3蛋白后，调控细胞增殖的蛋白（cyclind1，CDK4，CDK6）表达水平也下调（图2D）。凋亡试验发现：敲除HOXA3蛋白后，可以促进SCC⁃9细胞的凋亡（图2E）。

图2 敲除HOXA3后口腔癌细胞生长及凋亡情况Fig.2 Growth and apoptosis of oral cancer cells after HOXA3 knockout

2.3 敲除HOXA3后可以抑制口腔癌细胞侵袭能力 笔者接着研究HOXA3对口腔癌细胞侵袭能力的影响。Transwell实验提示：敲除HOXA3之后，细胞迁徙能力下降（图3A）。划痕实验也与Transwell结果一致，提示下调HOXA3表达可抑制口腔癌细胞迁徙能力（图3B）。Western blot实验提示：敲除HOXA3蛋白后，调控细胞侵袭的蛋白（MMP1，MMP2，MMP9）表达水平也下调（图3C）。

图3 敲除HOXA3对口腔癌细胞侵袭能力的影响Fig.3 Effect of knockout HOXA3 on invasive ability of oral cancer cells

2.4 HOXA3对裸鼠成瘤能力的影响 最后笔者探讨HOXA3是否影响裸鼠体内成瘤能力。研究发现，敲除HOXA3之后，SCC⁃9细胞在裸鼠体内生长速度明显减弱（图4A），其成瘤大小及重量也明显小于空白对照组（图4B）。这些实验表明：下调HOXA3之后，可减弱口腔癌细胞的体内成瘤能力。

3 讨论

口腔癌是常见的头颈部恶性肿瘤之一，约占全身恶性肿瘤的3%［5］。口腔癌5年生存率约为55%～60%，为危害人类健康的常见肿瘤之一［5］。在我国，口腔癌的发病率近期有上升的趋势。

图4 HOXA3对裸鼠成瘤能力的影响Fig.4 The effect of HOXA3 on the tumorigenicity of nude mice

口腔癌的发生及进展是多因素、多步骤、多阶段的复杂过程，其中，基因表达的异常为口腔癌发病的重要原因［6］。癌基因的激活及过度表达为口腔癌病变的分子机制之一［7］。在基因水平明确口腔癌的发病机制，对口腔癌的早期诊断，个体治疗及开发新治疗靶点具有重要意义。

HOXA3是同源异型盒基因（homeobox genes，HOX）家族成员之一。HOX基因是一类在进化上高度保守的基因，可调控机体的正常发育。但是，HOX基因异常表达通常导致了恶性肿瘤的发生及进展［8］。例如：HOXA基因与子宫内膜癌的发生相关。HOXA10在低分化子宫内膜癌中高表达，其表达水平升高预示预后不良［9］。HOXA1可作为乳腺癌主要的致癌因子，其可促进乳腺癌对化疗药物阿霉素的抵抗［10］。在消化系统肿瘤中，HOX家族基因可促进结肠癌的发病以及远处转移［4］。这些研究结果表明：HOX家族基因的异常表达可作为促癌因素，导致肿瘤的发生及远处转移。

本研究首先通过分析GEO芯片，发现在口腔癌组织中，HOXA3表达水平较癌旁组织升高。进一步采用RT⁃PCR分析临床口腔癌组织样本，初步证实了GEO芯片结果。我们还使用western blot检测了口腔癌组织样本中HOXA3的含量，结果与RT⁃PCR一致。免疫组化也发现HOXA3在口腔癌组织中表达上调。这些结果提示HOXA3可能作为促进口腔癌进展的一个癌基因。

在后续的功能实验当中，笔者首先降低了SCC⁃9口腔癌细胞株中HOXA3的表达。平板克隆、MTT等试验提示：降低了HOXA3表达水平之后，口腔癌SCC⁃9细胞的生长能力下降，并且发生了凋亡。敲除HOXA3之后，促进细胞生长的cyclinD1，CDK4，c⁃myc等蛋白分子也表达下调。这些结果表明：HOXA3可以促进口腔癌细胞的增殖。Boyden及划痕试验提示敲除HOXA3之后，还减弱了口腔癌细胞的侵袭能力。MMP⁃1，MMP⁃2，MMP⁃9为可促进肿瘤细胞侵袭及远处转移的重要分子。我们发现敲除HOXA3之后，可以降低MMP⁃1，MMP⁃2以及MMP⁃9的表达。这些结果提示HOXA3可以促进口腔癌细胞的侵袭。本研究首先发现HOXA3是口腔癌发病的重要癌基因，它可以通过促进口腔癌细胞生长，以及增殖发挥其相关作用。当然，本研究也存在不足之处：在机制上的研究尚不充分，HOXA3是通过哪个相关信号通路发挥其生物学作用，在本研究中尚未充分阐明。在后续的研究中，我们将继续探讨HOXA3的分子作用机制。

综上所述，HOXA3可作为促进口腔癌增殖及侵袭的重要因子。针对HOXA3这个靶点可能为口腔癌的治疗提供新的思路以及治疗方式。

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