HBx上调TGF⁃β/TβR⁃Ⅱ通路对肝细胞癌索拉菲尼耐药的影响

邢健鹦 何远学 曾洪兰 陈家诚 周钰 沈群 周文珂 陈晓玲叶文玉 武金才

海南省人民医院1预约诊疗服务中心，2传染科，3肝胆外科，4门诊部，5胆胰外科（海口570311）

在我国，肝细胞癌是极为常见的一种恶性肿瘤，具有早期诊断率低、进展快与病死率高等特点［1］。特别是多数患者在就诊时已为晚期，失去了手术治疗机会，大多进行化疗。但因为肝细胞癌在早期的诊断率不高，确诊时常常已经进入晚期，已然失去根治机会［2-3］。在治疗肝细胞癌时，化疗能够对治疗起到很好的辅助效果，可是对于化疗药物，肝癌细胞的敏感性较差，极易形成耐药性。在临床治疗上，索拉菲尼是一种多激酶抑制剂，能够起到抑制抗血管生成以及肿瘤细胞增殖等作用，在肝细胞癌中的应用多见［4］。但是由于先天或获得的耐药性导致索拉菲尼延长肝细胞癌的中位生存期有限，为此需要积极研究肝细胞癌索拉菲尼耐药的影响机制［5-6］。HBX基因是HBV重要的功能基因，也是乙型病毒性肝炎基因组中的一个多功能反式激活因子，在肝癌细胞中的整合率超过70.0%，是肝癌产生耐药性的重要原因之一［7］。经过研究发现，HBX基因在整合时能够利用ERK1/2信号通路在HIF⁃1α介导下促进多药耐药相关基因的转录，从而使肝癌细胞获得多药耐药的表型［8-9］。在肝癌细胞细胞通路传递中，TGF⁃β通过受体复合物传递信号，辅助受体能促进相关受体复合物的形成，并决定TβR⁃Ⅱ的特异性，TβR⁃Ⅱ可通过磷酸化Ⅰ型受体的GS区而激活Ⅰ型受体的激酶活性，然后在肝脏慢性炎症促进肝癌发生过程中发挥重要作用［10-12］。本课题应用多种方法来探究HBx上调TGF⁃β/TβR⁃Ⅱ通路对肝细胞癌索拉菲尼耐药的影响，具体分析肝癌细胞产生多药耐药性的分子机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 稳定转染HBX蛋白的HepG2⁃HBx细胞与转染pcDNA3.1质粒的HepG2⁃3.1细胞均在本实验室长期保存及培养，所有细胞均用10%灭活胎牛血清、RPMI1640培养基，在温度为37℃、5%CO2的恒温培养箱进行培养。DMEM（Gibco公司）、胎牛血清（FBS，Gibco，USA）、胰蛋白酶（Gibco公司），MTT（Sigma公司），索拉菲尼（Sigma公司），TGF⁃β、HBx抗体（Cell Signaling Technology，CST）；免疫荧光试剂（Santa Cruz公司）。

1.2 细胞处理 HepG2⁃HBx细胞与HepG2⁃3.1细胞培养于含1 mg/mL G418的完全培养基中，以维持其抗性表型，37℃、5%CO2条件下培养。以含梯度浓度的索拉菲尼的培养基调整细胞浓度为1×105个细胞/孔，培养24 h后接种于96孔中，以含梯度浓度的索拉菲尼的培养基培养72 h后，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，孵育4 h后终止培养。每孔加入酸化的DMSO 100 μL，于酶标仪检测波长为570 nm时的吸光度A值，绘制细胞生长曲线。肝癌细胞抑制率（%）=［（A对照组-A实验组）/A对照组］×100%，重复3次，然后计算索拉菲尼的IC50值。

1.3 流式凋亡检测 HepG2⁃HBx细胞与HepG2⁃3.1细胞分别接种于24孔板中后，至80%密度时，分别换用含50 μg/mL的索拉菲尼的完全培养，作用24 h后消化收集细胞，PBS洗涤3次，用annexinV⁃FITC 结合缓冲液（5 μL annexin V⁃FITC stock与10 μL PI）重悬细胞，调整细胞密度约5×105/mL左右。室温下进行10 min孵育，利用流式细胞仪进行检测，通过运用软件CellQuest来分析细胞凋亡情况。

1.4 免疫印迹分析 消化收集HepG2⁃HBx细胞与HepG2⁃3.1细胞，用IP裂解液裂解细胞，冰上放置 30 min，12 000 r/min离心10 min，收集上清，装成小份冻存于-80℃，按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行操作，使用GE公司提供的软件ImageQuant进行灰度扫描和分析，并得出蛋白的相对表达量，以β⁃actin作为内标。

1.5 统计学方法 在此次实验中，运用软件SPSS 20.00展开分析，采用均数±标准差与百分比来描述计量资料与计数资料，计量数据与计数数据的对比为t检验与卡方分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 耐药性对比分析 应用免疫印迹技术鉴定HepG2⁃HBx细胞与HepG2⁃3.1细胞的HBX蛋白表达情况，可见HepG2⁃HBx细胞的HBX蛋白表达明显高于普通的HepG2⁃3.1细胞（P＜ 0.05）。见图1。为研究HBX是否会引起肝癌细胞耐药性增加，以索拉菲尼处理HepG2⁃HBx细胞与HepG2⁃3.1细胞72 h后再行MTT检测，结果显示索拉菲尼对HepG2⁃HBx细胞的 IC50值为 HepG2⁃3.1 细胞的4.65倍。

图1 HepG2⁃HBx细胞与HepG2⁃3.1细胞的HBX蛋白表达Fig.1 The expression of HBX protein in HepG2⁃HBx cells and HepG2⁃3.1 cells

2.2 细胞凋亡对比 采用annexinV/PI法比较了HepG2⁃HBx细胞与HepG2⁃3.1细胞的凋亡率，结果显示索拉菲尼作用24 h后，HepG2⁃HBx细胞的凋亡率要明显低于HepG2⁃3.1细胞的凋亡率（P＜0.05）。见表1。

2.3 耐药相关蛋白检测分析 经培养24、48、72 h后的HepG2⁃HBx细胞与HepG2⁃3.1细胞进行收集，提取蛋白进行免疫印迹法检测TGF⁃β蛋白表达，结果显示HepG2⁃HBx细胞较HepG2⁃3.1细胞的多药耐药蛋白TGF⁃β表达量明显增高（P＜0.05）。见图2。

表1 经过索拉菲尼处理的不同细胞的细胞凋亡率对比Tab.1 The rate of cell apoptosis in different cells treated by sorafenib ± s，%

表1 经过索拉菲尼处理的不同细胞的细胞凋亡率对比Tab.1 The rate of cell apoptosis in different cells treated by sorafenib ± s，%

细胞HepG2⁃HBx细胞HepG2⁃3.1细胞t值P值n33细胞凋亡率13.56±2.19 4.89±1.63 8.392＜0.05

图2 耐药相关蛋白检测对比Fig.2 Detection and comparison of drug resistance related proteins

3 讨论

乙肝是当今主要的传染病之一，目前全球乙肝患者超过4亿人，其中部分患者可发展为肝细胞癌。虽然化疗为肝癌的主要治疗方法，但是临床发现肝癌对化疗并不敏感，而肝癌组织常表达多药耐药基因，这可能与肝癌对化疗的低应答有关［13-14］。

HBX感染跟肝细胞癌的形成及发展存在密切关系，在HBV基因组当中，HBX基因是功能基因，能够发挥重要作用，能直接或间接地在乙肝进展为肝癌时发挥重要影响［15］。在HBV病毒基因组当中，HBV的X基因是最小的开放性读码框，全长435～462 bp，编码长度为154个氨基酸的蛋白（HBx）。经过研究发现，HBx蛋白在NF⁃κB、TGF⁃β通路等多条细胞信号转导通路中都有参与，HBx蛋白的过度表达能够对细胞转化起到诱导作用，而且HBx蛋白可以跟抑癌基因p53产生相互作用，让其失去原有功能［16-17］。索拉菲尼是目前唯一对肝癌有效的分子靶向药物，临床上也将索拉菲尼作为晚期肝癌的首选也是唯一治疗药物，但是耐药性也比较明显。本研究显示索拉菲尼对HepG2⁃HBx细胞的 IC50值为HepG2⁃3.1细胞的4.65倍，表明HBX上调可导致肝癌细胞对索拉菲尼药物产生更好的耐药性，说明在肝癌细胞形成耐药性时HBX蛋白起到重要作用［18］。经过HIF⁃1α的介导，HBX基因能够对多药耐药有关基因转录起到促进作用，使得化疗药物的非选择性外排增加，肝癌细胞得到多药耐药表型［19］。HBx蛋白也参与了肝癌细胞的耐药及免疫逃避，也能调节细胞自噬作用。有研究表明HBX基因整合于宿主HepG2细胞基因组后，加快了有害大分子物质的循环，也可能通过改变了宿主细胞的自噬水平，对暴露于化疗药物下的癌细胞起到了保护作用，使得肝癌细胞的耐药性增强［20］。

现阶段，在治疗晚期肝细胞癌时主要采用的手段有生物治疗、化疗等，主要是诱导癌细胞凋亡，从而起到抗肿瘤效果［21］。化疗药物能够诱导细胞凋亡，敏感性主要是依赖前凋亡与抗凋亡信号的平衡。如今，在治疗肝癌时碰到的难题就是耐药性，在我国，乙肝的发病率相对较高，经过研究证明形成肝癌的一个主要诱因就是HBV［22］。本研究结果显示索拉菲尼作用24 h后，HepG2⁃HBx细胞的凋亡率要明显低于HepG2⁃3.1细胞的凋亡率（P＜0.05），表明HBX的表达上调能抑制肝癌细胞的凋亡，从而发挥耐药作用。

若发现耐药过程当中发挥关键作用的信号通路与分子，且正好是对应靶向药物，那么就可以降低肝癌细胞的耐药性。HBX蛋白的稳定表达对HepG2细胞的生物学行为产生了影响，HBX蛋白参与并提升了化疗药物外排，使得细胞系增强了耐药性［23］。基础研究显示VEGFA的扩增预示着对索拉菲尼的敏感性增加，Atf2信号通路也影响索拉菲尼药物敏感性。TβR⁃Ⅱ/TGF⁃β通路在调控肝脏炎症促进肝癌发生过程中起到重要作用，在人类肝癌当中，TGF⁃β信号通路普遍失活，而且TβR⁃Ⅱ受体基因表达明显降低，抑制性Smad7表达升高［23］。基础研究表明外源性TGF⁃β能够对包含完整TGF⁃β信号通路的细胞增殖进行抑制，TβR⁃Ⅱ表达沉默后，细胞生长迟缓、凋亡显著增加［24-25］。植入TβR⁃Ⅱ基因沉默的肝癌细胞后，体内实验发现肝癌生长受到抑制［26］。本研究免疫印迹检测显示HepG2⁃HBx细胞较HepG2⁃3.1细胞的多药耐药蛋白TGF⁃β表达量明显增高（P＜0.05）。也表明HBX诱导和上调了TβR⁃Ⅱ的表达，肝癌细胞主动性降低胞内化疗药物浓度的作用增强，导致肝癌细胞产生耐药性。也有研究表明TβR⁃Ⅱ在肝癌中灭活有利于肿瘤细胞逃避其抑制细胞增殖的作用，影响肝癌恶性程度、侵袭能力等生物学特性［27-28］。

总之，HBx可通过上调TGF⁃β/TβR⁃Ⅱ通路的表达，从而提高索拉菲尼对肝癌细胞的耐药性，降低细胞凋亡率，HBx是引起肝癌细胞耐药的重要因素之一。

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