基因HLA⁃DR13、CW1及A24表达、BCP突变与HBV感染者性别的相关性

杨小蓉 秦建川 冯致婷 黄演婷 王卫闯

广东药科大学附属第一医院 1检验科，2病理科（广州510080）

乙型肝炎病毒（HBV）感染后宿主会出现一系列不同的结局：如急慢性肝炎、携带者、肝硬化、肝癌［1］或者自动清除病毒并产生保护性抗体。绝大多数流行病学研究表明，HBV感染后存在明显的性别差异，在无症状携带者中的男女比例为1.2∶1，慢性肝炎为2.1∶1，重型肝炎肝硬化患者为（3.5 ～ 5.0）∶1，肝细胞癌为6.9∶1［2］。与HBV感染后结局相关的宿主基因HLA⁃DR13、HLA⁃A24、HLA⁃CW1表达、BCP基因突变、T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+比值在不同性别人群的相关研究，目前鲜有报道。笔者在前期研究基础［3］之上，采用实时荧光定量PCR技术检测患者血液中白细胞HLA⁃DR13、CW1及A24基因水平，流式细胞仪检测T淋巴细胞CD4+、CD8+表达，测序法检测样本基本核心启动子（BCP）变异，并分析相关因素与不同性别的人群中的差异表达之间的相关性，为下一步性激素受体信号通路在HBV感染后的作用研究打下基础。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择在2011年4月至2012年4月来广东药科大学附属第一医院就诊的215例HBV感染者，其中女性感染组42例，男性感染组40例；女性自动恢复组65例，男性自动恢复组68例。男108例，女107例，年龄15～81岁，平均（44±4.4）岁；均排除HAV、HCV、HDV及HEV感染，排除EBV、CMV感染，排除自身免疫性肝病、酒精性肝病及脂肪肝。诊断符合2005年第六次全国传染病与寄生虫病会议修订的《病毒性肝炎防治指南》标准［4］。

1.2 方法

1.2.1 标本收集 抽取患者静脉血3 mL，分离血清，用于BCP检测；抽取EDTA⁃Na抗凝全血2 mL，运用酚-氯仿-异戊醇方法提取白细胞中DNA，用于检测HLA⁃DR13、CW1及A24基因表达备用，并运用流式细胞术（FCM）检测CD4+、CD8+T淋巴细胞。

1.2.2 FCM检测CD4+、CD8+T淋巴细胞 试验所用流式细胞仪、免疫荧光标记抗体均为美国BD公司产品。在专用流式检测管（FACS管）中首先加入单克隆抗体 CD4⁃FITC/CD8⁃PE/CD3⁃PE⁃Cys 2 μL，加入25 μL EDTA⁃Na抗凝混匀全血，混匀后避光孵育30 min后加入溶血素500 μL，混匀后室温避光溶血15 min，用2 mL PBS洗液洗涤，混匀后离心（1 500 r/min，5 min），弃上清液后重复一次洗涤程序。最后加入500 μL PBS洗液，混匀后避光放置，上机检测。

1.2.3 检测HLA⁃DR13、A24*1、CW1基因表达引物合成及测序均在上海生物工程公司完成，电泳仪为北京六一仪器厂，pMD载体为日本TAKARA公司产品，在HLA⁃DR13、A24*1、CW1序列（Genbank登录号：HSU58978、AH004915.2、AH011749.2）CDS区域设计 3 对引物：5′⁃CCTGGACAGATACTTC⁃CATAACCA⁃3′，5′⁃TCGTCTTCCAGGATGTCCTTCT⁃3′［3］；5′⁃AGGTATTTCT CCACATCCGTGTCC⁃3′，5′⁃CTTTCCCTGTCTCCTCGTCCC⁃3′；5′⁃CGCTTCATCT⁃CAGTGGGCTACG⁃3′，5′⁃GCTCACTCGGTCAGTCT⁃GTGCC⁃3′。普通PCR扩增出135、184、171 bp的片段后，连接，转化，测序，酶切鉴定后，连接载体pMD20，按照104～107copies/mL稀释倍数稀释，实时荧光定量PCT检测各稀释倍数质粒（反应条件：95℃变性30 s，95℃ 5 s，60℃退火30 s，30个循环）。最后制作标准曲线，检测各组HLA⁃DR13、A24和CW1基因表达量。

1.2.4 扩增BCP序列 运用等位基因扩增方法，在HBV的X基因BCP序列（Genbank登录号：NC_003977）BCP1762/1764突变位点处设计3个引物：5′⁃AATGGTCTTTGTACTAGGAG⁃3′，5′⁃AAAGATC⁃TTTGTACTAGGAG⁃3′，5′⁃ATGTTCCGGAGACTCTA⁃AG⁃3′，扩增出312 bp的片段，以2%琼脂糖凝胶电泳检测后送公司测序。

1.3 统计学方法 运用SPSS 17.0分析，所有的定量值均以log10对数转换，计量资料组间差异比较用方差分析，阳性率的比较采用卡方检验，以α=0.05为检验标准，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组HLA⁃DR13、A24*1及CW1定量结果比较 HLA⁃DR13以男性HBV感染组最低，与女性感染组及男、女自动清除组结果比较差异有统计学意义（P=0.009，0.032，0.004，P＜ 0.05），而女性HBV感染组及男、女自动清除组HLA⁃DR13表达量较高，组间差异无统计学意义（P＞0.05）；4组HLA⁃A24和HLA⁃ACW1的结果比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 4组病例HLA⁃DR13、HLA⁃A24及HLA⁃CW1基因real⁃time PCR定量结果比较Tab.1 Comparison of HLA⁃DR13，HLA⁃A24 and HLA⁃CW1 levels among four groups ±s

表1 4组病例HLA⁃DR13、HLA⁃A24及HLA⁃CW1基因real⁃time PCR定量结果比较Tab.1 Comparison of HLA⁃DR13，HLA⁃A24 and HLA⁃CW1 levels among four groups ±s

注：与其他3组比较，*P＜0.05

组别HBV感染组(女性）HBV感染组（男性）HBV自动清除组（女性）HBV自动清除组（男性）例数42 40 65 68 HLA⁃DR13 2.72±1.86 1.76±1.02*2.69±2.10 2.56±1.68 HLA⁃A24 2.30±1.82 2.26±1.90 2.22±1.63 2.13±1.67 HLA⁃CW1 2.16±1.95 2.25±1.80 2.31±1.87 2.20±1.64

2.2 各组T细胞亚群结果 以男性HBV感染组CD3+CD4+T细胞百分率最低，与其他3组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），男女自动清除组显著大于男女感染组，差异有统计学意义（P＜0.05）；4组CD8+T细胞百分率比较差异无统计学意义（P＞0.05）；以女性HBV感染组CD4+/CD8+结果最低，男性HBV感染组其次，男女HBV感染组与男女自动清除组相比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组T细胞CD3+CD4+、CD3+CD8+及CD4+/CD8+结果比较Tab.2 Comparison of CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD4+/CD8+results among four groups ±s，%

表2 各组T细胞CD3+CD4+、CD3+CD8+及CD4+/CD8+结果比较Tab.2 Comparison of CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD4+/CD8+results among four groups ±s，%

注：与其他3组比较，*P＜0.05

组别HBV感染组（女性）HBV感染组（男性）HBV自动清除组（女性）HBV自动清除组（男性）例数42 40 65 68 CD3+CD4+34.15±9.09*31.63±9.20*39.72±7.02 39.69±6.68 CD3+CD8+26.99±7.88 24.82±9.05 21.50±3.82 22.35±4.69 CD4+/CD8+1.39±0.61*1.47±0.77*1.88±0.38 1.82±0.37

2.3 4组各检测项目相关性比较 HLA⁃DR13与HLA⁃A24及CD4+结果呈显著正相关（P＜ 0.05），HLA⁃A24与HLA⁃CW1呈显著正相关（r=0.42，P=0.000），CD4+T细胞结果与CD4+/CD8+呈显著正相关（r=0.60，P=0.000），CD8+T细胞结果与CD4+/CD8+呈显著负相关（r=-0.71，P=0.000），见表3。

表3 各组HLA⁃DR13、A24、CW1、CD4+、CD4+/CD8+之间相关性Tab.3 Association of HLA⁃DR13，A24 CW1，CD4+，CD4+/CD8+results

2.4 BCP电泳及测序结果 运用等位基因扩增PCR法，扩增出312 bp片段，见图1。测序后男女阳性率比较结果见图2，女性HBV感染组BCP突变率为0.24（10/42），且全部为单突变，而男性HBV感染组突变率为0.19（13/68），其中单突变为0.16（11/68），双突变为0.03（2/68），与女性HBV感染组结果比较差异有统计学意义（P＜0.01）。

图1 HBV感染组BCP突变电泳图Fig.1 Electrophoresis map of BCP gene mutation in patients with HBV infection

图2 男女BCP突变率的比较Fig.2 Comparison of the ratio of BCP gene mutation in male and female

3 讨论

慢性HBV感染后的发生发展是一个多种因素合力作用的结果，除了环境和病毒的相互作用外，疾病的最终转归主要取决于宿主的免疫功能状态，与遗传相关的免疫因素可能是导致HBV相关肝脏疾病的主要机制［5］。人类白细胞抗原（HLA）基因复合体所表达的基因产物，除直接构成异体移植排斥反应的靶抗原外，在免疫应答的过程中发挥着非常重要的调控作用，也反映了自身免疫性疾病的基因易感性［6］，与HBV感染后临床结局密切相关，ALBAYRAK 等［7］的研究表明：接种乙肝疫苗后，非应答者的HLA⁃A24及HLA⁃A11频率显著高于乙肝疫苗有应答者，而非应答者的HLA⁃CW6的频率显著低于乙肝疫苗有应答者。HBV感染后的发展结局有明显的性别差异，流行病学研究［8］表明，在感染HBV后发展为肝癌的男性约为女性的3倍。本研究中，将82例HBV感染后的患者分为男性组和女性组，将133例自动清除HBV者根据性别分为男性和女性组，通过荧光定量PCR分析，HLA⁃DR13以男性HBV感染组最低，与女性感染组及男、女自动清除组结果比较差异有统计学意义（P＜ 0.05），4组HLA⁃A24和HLA⁃CW1的结果之间差异无统计学意义（P＞0.05）。相关性分析发现了 HLA⁃DR13基因及 CD4+、CD4+/CD8+之间属于正相关关系，而男女感染组与男女自动清除组的CD4+及CD4+/CD8之值相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。在感染HBV后，机体主要以3种途径清除病毒：（1）T淋巴细胞CD8+CTL直接杀灭途径；（2）CTL直接诱导表达呈递病毒抗原的肝细胞凋亡；（3）CTL产生和分泌非细胞毒性淋巴因子，抑制病毒基因的表达和病毒基因组的复制，从而干扰病毒的生活周期；HLA⁃DR属于HLAⅡ类分子，在机体对HBV的免疫应答过程中，肝组织内的巨噬细胞可以表达高水平的高效递呈病毒抗原给HLAⅡ类分子限制的CD4+T细胞，CD4+T细胞的主要作用是通过分化成不同的细胞群而间接调节免疫应答［9］，如果肝组织受到损伤导致CD4+表达量不足，影响CD4+T细胞被激活，进而影响到分化的Th1和Th2细胞，导致细胞免疫和体液免疫途径受到影响，对人肝细胞移植（HUHEP）小鼠模型的研究结果表明，HBV感染的小鼠炎症及免疫抑制细胞因子程度与肝内CD4+T细胞数量相关，病毒载量高的小鼠会引起肝脏祖细胞的感染，这可能是导致肝癌发生的新机制［10］。由此可见，在本研究中HLA⁃DR13与CD4+T细胞表达呈正相关，也可能是HLA⁃DR13递呈的HBV核心抗原可诱导更为强烈的CD4+T细胞增殖反应，进而影响到乙型肝炎病毒感染宿主后能否自动被清除。HLA⁃A24与HLA⁃DR13及CW1呈正相关关系，但是在4组比较中均无统计学意义，可能与HLA⁃A24与乙肝疫苗的反应性有关，而HLA⁃CW1则与临床抗病毒治疗后的疗效相关［11］。

HBV为嗜肝病毒，为双链DNA，病毒在复制的时候需先转录成RNA（前病毒基因组），然后再逆转录成子代病毒DNA。病毒编码有逆转录酶，其基因结构共有4个开发阅读框（ORF）：S、C、P和X，编码7种病毒蛋白：即S区的前S1和S2蛋白和主蛋白（HBsAg），C区包括前C区及核心区，基本核心启动子区（BCP）位于核心区内，C区编码HBeAg和HBcAg蛋白，P区编码P蛋白和X区编码HBxAg蛋白［12］。HBV复制的过程中，通常会由于多种因素导致序列突变，而最常见的突变莫过于逆转录酶经常性发生的随机错误，BCP区和前C区是其中最常见的突变域，亦有研究表明：HBV有调节宿主细胞表达和甲基化的能力，从而导致突变［13］。本研究的数据表明：病毒因素也有性别差异，BCP突变检测结果为：女性HBV感染组BCP且全部为单突变，突变率为24%，且全部为携带者，与相关研究结果［14］（无症状病毒携带者中的前C区突变率高于慢性乙型肝炎及急性肝炎患者，它们的发生率分别为33.7%、16.1%、13.6%）较为接近；而男性HBV感染组突变率其中单突变为16%，双突变为3%，与女性HBV感染组结果比较差异有统计学意义（P＜0.01）。进一步提示BCP突变对于男性而言，雄激素途径在分子水平上通过靶向病毒增强子Ⅰ而起到增强HBV转录作用［15］，进而加重病情，导致男女感染HBV后不同的临床结局。

感染性疾病的遗传易感性受到多种层次水平和途径的制约，除了宿主的HLA、淋巴细胞共刺激分子及其配体和病毒因素外，还跟肠道菌群结构及丰度相关［16］，这些因素均会直接影响感染的起始和疾病的进程。本研究中HLA⁃DR13、A24、CW1、T淋巴细胞功能及病毒因素的性别差异为下一步雌激素/雄激素受体信号通路研究奠定了基础，为进一步揭开性别差异引起的HBV感染后的不同结局，从而有的放矢地实行精准治疗提供思路。

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