调节性T细胞与吲哚胺2，3-双加氧酶在乙肝感染者外周血中表达的相关性

杨峻 王前 石青峰 苗海霞 吕仁华南方医科大学（广州5055）；桂林医学院附属医院检验科（广西桂林5400）；桂林出入境检验检疫局保健中心（广西桂林54004）

全球约有4亿人曾经感染过乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV），慢性携带者超过3.7亿［1］，其中我国约1.2亿［2］。感染者对HBV抗原的免疫应答不足是HBV慢性持续感染状态和慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的重要发病机制［3］。吲哚胺-2，3双加氧酶（indoleamine 2，3⁃dioxygen⁃ase，IDO）作为色氨酸沿犬尿氨酸代谢途径的限速酶，在病毒感染及肿瘤发生发展中起重要作用［4］，IDO可导致细胞微环境中色氨酸的耗竭，从而使细胞处于一种“色氨酸饥饿”状态，对于迅速分裂期的细胞或病原微生物尤为敏感。调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）是一群特殊的CD4+CD25+CD127-T细胞亚群，具有免疫抑制和免疫无能的特性，可控制外周自身免疫反应，导致对肿瘤及感染性疾病的免疫耐受［5］。有研究表明［6］，IDO不但“剥夺”病原微生物的色氨酸，同时也“剥夺”T细胞的色氨酸，导致T细胞凋亡，但IDO与Treg细胞间的调控关系尚未明晰。近年来，IDO与Treg细胞在HBV慢性感染中的作用受到广泛关注，但具体机制尚未明了。本研究旨在通过分析乙肝患者外周血中的IDO表达情况、丙氨酸氨基转移酶（ALT）以及CD4+CD25+CD127-T细胞各指标间的相关性，初步探讨外周血中IDO表达上调与Treg细胞之间的关系，为CHB的发病机制及临床研究提供一些实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 共纳入2012年9月至2014年1月我院收治的不同感染状态的HBV感染者142例，男 75例，女67例；年龄 18～66岁，平均（41.7±10.2）岁。将其分为4组：CHB组44例，急性乙型肝炎组（acute hepatitis B，AHB）31例，肝硬化组（HBV⁃related liver cirrhosis，LC）29例和肝癌组（HBV⁃related hepatocellular carcinoma，HCC）28例。对照组28例，均为未患有肝炎的健康人群，男16例，女12例；年龄19～49 岁，平均（39.5±7.9）岁。各组研究对象的基线资料具有可比性，见表1。

表1 各组研究对象年龄和性别的比较Tab.1 Comparison of age and sex between groups

1.2 纳入标准 AHB及CHB组诊断标准均参考2015年《慢性乙型肝炎防治指南》［2］，AHB 为6个月以内出现HBsAg和（或）HBV DNA阳性，伴有ALT＞38 IU/L及肝功能异常；CHB患者均为HBsAg和（或）HBV DNA阳性6个月以上，伴有ALT＞38 IU/L及肝功能异常。HCC患者均符合2017年《原发性肝癌诊疗规范》［7］诊断标准，HBsAg阳性且AFP≥400 ng/mL；LC组均符合2014年《乙型肝炎病毒相关肝硬化的临床诊断、评估和抗病毒治疗的管理》［8］诊断标准，HBsAg阳性且病理学确证肝硬化结节已完全形成。

1.3 排除标准 （1）药物性肝炎、自身免疫性肝病、酒精性肝病及其他类型病毒性肝炎者。（2）合并严重心、肝、肾慢性疾病患者；（3）排除妊娠及生殖腺胚胎源性肿瘤；（4）病历资料不完整者；（5）近期合并其他感染的患者；（6）不能完成随访的患者。

1.4 方法

1.4.1 标本采集与检测 本研究经医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。所有患者均在清晨空腹采集静脉血，用EDTA抗凝试管采集2管，每管5 mL，用肝素锂抗凝试管采集1管，3 mL，立即送检。

1.4.2 流式细胞检测 （1）流式细胞分析仪型号为EPICS XL，美国贝克曼公司生产。溶血素、鞘液及鼠抗人CD4-CP/CD25-PE/CD127-FITC均购自美国贝克曼公司。（2）标本制备：在装有100 μL抗凝全血的试管中分别加入5 μL鼠抗人CD4-CP/CD25-PE/CD127-FITC单抗混匀，室温下避光孵育15 min，加入溶血素1 mL混匀，避光放置12 min，1 500 r/min离心5 min，弃上清液，再次加入PBS 2 mL，1 500 r/min离心5 min，弃上清液，加入PBS 300 μL重悬细胞，上流式细胞仪检测。

1.4.3 IDO mRNA检测

1.4.3.1 分离外周血单个核细胞（PBMC） 用淋巴细胞分离液（Ficoll⁃Paque）进行密度梯度离心（于22℃3 300 r/min离心20 min）获取PBMC。

1.4.3.2 主要试剂及引物 Trizol使用Invitrogen公司产品；PCR试剂盒使用Toyobo公司生产的RNA⁃directed SYBR Green RT⁃PCR Master Mix。引物设计及合成：引物均遵循引物设计原则进行设计，引物序列由Invitrogen公司合成。

1.4.3.3 IDO mRNA的提取和逆转录 PBMC IDO mRNA提取按照试剂盒（QIAGEN）说明进行。逆转录反应使用MBI逆转录试剂盒，按说明进行操作。

1.4.3.4 荧光实时定量PCR检测 荧光实时定量PCR检测（RT⁃PCR）所用染料为DYBR Green。反应条件：预变性93℃ 2 min，扩增93℃10 s，58℃30 s，40个循环，扩增循环结束后进行熔点曲线检测：45～90℃，升温速度0.2℃/s，连续检测荧光；最后降温至40℃；扩增结束后，利用配套软件进行检测和分析。

1.4.4 ALT活性检测 ALT检测试剂盒购自罗氏诊断有限公司，使用罗氏Cobas C702全自动生化分析仪按操作说明进行检测。

1.5 统计学方法 应用SPSS 19.0统计软件，计量资料以±s表示，组间比较使用方差分析，相关性分析采用Pearson检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 IDO mRNA IDO mRNA表达总体组间比较差异有统计学意义（P=0.000），见表2。IDO mRNA表达从高到低依次为HCC组、AHB组、CHB组、LC组和对照组。HCC组明显高于其他4组（P＜0.01），其余各组间两两比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 外周血IDO mRNA、转氨酶及Treg细胞计数结果比较Tab.2 Comparison between IDO mRNA，ALT and Treg in the blood samples ±s

表2 外周血IDO mRNA、转氨酶及Treg细胞计数结果比较Tab.2 Comparison between IDO mRNA，ALT and Treg in the blood samples ±s

注：与LC组比较，#P ＜0.05；与HCC组比较，△P ＜0.05，与AHB组比较，▲P＜0.01；其他数据各组间两两比较，均P＜0.05

组别对照组CHB组AHB组LC组HCC组F值P值例数28 44 41 29 28 IDO mRNA（× 103copies/mL）0.67± 0.41△1.11± 0.62△1.22± 0.77△1.05± 0.47△2.63±0.84#▲37.793 0.000 ALT（U/L）17.96 ± 10.87△▲71.50 ± 41.39△▲123.39 ± 104.28△#51.48±13.19▲61.25±24.94▲15.567 0.000 Treg细胞（%）2.87 ± 1.19△▲3.65±1.30△4.37±1.46#△4.04±1.20△9.62±3.67▲8.226 0.000

2.2 Treg细胞检测 总体组间比较，除CHB组外，各组Treg细胞与对照组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），其中HCC组明显高于其他3组（F=10.764，P=0.002），Treg计数从高到低依次为HCC组、AHB组、LC组、CHB组和对照组。见表2。

2.3 ALT检测结果 总体组间比较，除LC组外，各组ALT活性与对照组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表2。

2.4 Treg细胞、ALT、IDO mRNA相关性分析ALT活性与IDO mRNA表达相关性较低（r=0.196，P=0.026），Treg细胞与IDO mRNA表达呈正相关（r=0.912，P=0.000）。见图1。

3 讨论

图1 HBV感染患者外周血IDO mRNA、ALT、Treg表达相关性分析Fig.1 Correlation analysis between IDO mRNA，ALT and Treg in the blood of hepatitis B patients

HBV在病毒感染发生、发展过程中会演化出种种逃避免疫监视的方式，宿主自身免疫系统不能有效清除病毒而发生免疫耐受，HBV感染诱导自身免疫耐受的机制目前尚未完全阐明。近年研究表明［9-10］，IDO的高表达，可导致肿瘤或体液局部微环境中色氨酸耗竭，同时伴有Treg细胞水平增高的现象，两者相互作用与影响，可能导致病毒或肿瘤细胞逃避机体免疫系统的监视。IDO和Treg细胞的关系为研究HBV免疫耐受导致感染的机制提供了一个新的方向。

人体感染HBV后，体内抵御病毒的免疫反应主要为细胞免疫，如T淋巴细胞通过有效的溶细胞或非溶细胞机制清除病毒，感染即可得到控制；反之，病毒将长期存在［11］。HBV感染慢性化的原因主要是感染者对HBV抗原的细胞免疫应答不足，表现为免疫耐受。HBV可诱导T淋巴细胞发生凋亡。本研究中，各实验组IDO mRNA表达与对照组相比较，差异有统计学意义。HCC组IDO mRNA表达增高说明，IDO通过分解代谢色氨酸抑制免疫细胞功能，是机体免疫耐受功能的重要调节因子［12］。IDO表达的上调导致机体参加免疫反应的免疫活性细胞不足，致机体免疫功能低下，HBV不能有效清除。而AHB组和CHB组感染患者IDO mRNA表达均较对照组增强，说明HBV感染早期病毒诱导上调IDO，抑制细胞免疫反应，导致免疫反应不足，使病毒持续存在。在CHB组中的IDO表达持续升高导致免疫抑制和减少T淋巴细胞反应，为病毒播散及持续感染创造了条件，使感染慢性化形成恶性循环［13］。而LC组中IDO mRNA表达与对照组比较差异无显著性，表明在肝硬化发生时机体免疫抑制状态与正常组并无差距。

不少报道［14］指出IDO可以通过介导对色氨酸的降解及其代谢产物的作用来抑制T细胞的作用，从而帮助肿瘤逃避免疫监视。由于T细胞对色氨酸耗竭尤为敏感，在色氨酸浓度较低时，T细胞的增殖被抑制，细胞分化静止在G1期。这种静息的T细胞更容易凋亡，从而造成T细胞的缺乏。而色氨酸的分解代谢产物对T细胞的增殖也有抑制作用［15］，本研究在肝癌组与对照组中，均进行了Treg细胞流式检测，结果显示肝癌组中Treg细胞占CD4+T细胞比例为（9.62±3.67）%，高于其余各组，提示IDO的表达上调对Treg细胞没有明显的抑制作用。Treg计数从高到低依次为HCC组、AHB组、LC组、CHB组和对照组，且CHB组Treg细胞计数与对照组差异无显著性，说明随着HBV感染加重，导致肝脏功能恶化后Treg细胞的增加可能预示着预后不良。对Treg细胞的分析还表明，AHB组Treg细胞较对照组明显升高，而CHB组与对照组相比差异无显著性，说明在HBV急性感染期细胞免疫抑制增强，利于病毒感染发展，说明在乙肝患者病情进展中，随着细胞免疫的增强，抑制细胞免疫的作用亦加强，以维持机体免疫平衡［16］。

ALT与HBV感染状态下的肝功能损伤相关［17］，对ALT的活性研究表明，AHB组ALT活性最高，与其他各组相比较差异有显著性，LC组ALT活性与对照组相比差异并无显著性。本研究中各检测项目间相关性分析显示，在各实验组中，IDO mRNA表达与ALT无明显相关性（r=0.196，P=0.026），说明免疫抑制与肝细胞损伤间并无明显相关。而对各实验组IDO mRNA、Treg表达的相关性分析结果为r=0.912，P=0.000，表明患者外周血中IDO表达与Treg细胞数量间存在正相关性，即IDO高表达伴随着外周血Treg细胞比例增高，IDO和Treg细胞间可能存在着一个正反馈的调控环路，共同介导HBV的免疫耐受。而据曾道炳等［10］研究报道，IDO mRNA表达与CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞呈负相关。由于本研究的局限，IDO与Treg细胞间的具体调控机制尚不明确，有待进一步研究。

总之，IDO与Treg细胞的相互作用可能是HBV感染慢性化及免疫耐受的另一原因，对其深入研究可为慢性HBV感染的治疗提供一个全新思路。通过免疫学手段下调慢性HBV感染者的IDO与Treg水平，使特异性T淋巴细胞升高，可望重建患者的主动免疫，从而达到临床治愈。

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