氧化苦参碱通过抑制炎症因子活性调控细胞凋亡基因水平改善肝硬化大鼠肠黏膜屏障功能

陈卫国 文剑波 张潇

萍乡市人民医院 1肝病内科，2消化内科（江西萍乡337000）

肝硬化可由多种病因引起，为临床上发生率最高的慢性肝脏疾病，引起肝脏组织弥漫性纤维化，进而造成肝损害［1］。近年来，关于肝硬化引起胃黏膜的变化已经进行了较多的深入研究，而关于肠道黏膜的研究报道较少［2］。肝硬化的患者易发生细菌移位导致多种感染的发生，如血性腹泻、脓液、黏液以及排便期间的腹部绞痛等肠道感染［3］。肠黏膜于肠道细菌移位中起了重要的屏障作用，故肠黏膜屏障功能对肝硬化预后及并发症的预防有十分重要的作用［4］。目前常见关于肠道感染的治疗引入免疫学治疗的新方法的研究，如调节白细胞介素-10（interleukin⁃10，IL⁃10），阻断T细胞，阻断炎症细胞迁移及附着等，且以上方法均可在一定程度上减少不良反应的发生［5］。NF⁃κB是一种重要的核转录因子，可对各种促炎细胞因子基因进行调节。目前NF⁃κB主要包括NF⁃κB⁃1（p50及其前体 p105）、NF⁃κB⁃2（p52和其前体p100）、p65（RelA）、c⁃Rel（Rel）和RelB［6］。肠道发生感染时，肠道固有层的巨噬细胞NF⁃κB p65的表达增加，同时TNF⁃α及其他细胞因子与DNA结合的活性较高［7］。在其他肠炎模型中，NF⁃κB p65也被高度表达，并且设计针对NF⁃κB p65基因mRNA翻译起始位点的反义寡脱氧核苷酸可阻断NF⁃κB p65表达，进而达到消除急性炎症的作用［8］。氧化苦参碱（oxymatrine，OMT）在结肠炎的治疗中临床运用较广，主要是通过下调NF⁃κB的活性及其他炎症细胞因子，进而达到治疗的作用［9］。但关于NF⁃κB p65亚基的阻断机制及相关凋亡基因的机制尚未明确。故本实验探究四氯化（CCl4）碳诱导的肝硬化大鼠模型中，OMT能否通过改变细胞凋亡基因Bcl⁃2和Bax表达水平及下调NF⁃κB活性以及抑制炎症细胞因子的释放来改善肠黏膜屏障功能。

1 材料与方法

1.1 材料 选取正常雄性SD大鼠（上海斯莱克实验动物有限公司）50只，SPF级，体质量180～220 g，取10只不经处理的大鼠视为对照组，余下40进行肝硬化模型制备，制成肝硬化成模大鼠共30只。30只肝硬化成模大鼠分为2组，分别为模型组和治疗组，每组各15只。

1.2 研究方法

1.2.1 模型制备 采用四氯化碳皮下注射法进行大鼠肝硬化模型制备。40%四氯化碳橄榄油溶液，按照0.3 mL/kg进行皮下注射，首次剂量加倍，每周2次，持续注射12周［10］。分别于第4、8、12周各抽取大鼠1只，用于病理织学检查，12周后，制成的肝硬化成模大鼠共30只。

1.2.2 干预方法 治疗组大鼠给予5%葡萄糖溶液配置的OMT肌注（63 mg/kg），1次/d，持续4周；对照组、模型组大鼠均给予5%葡萄糖溶液（63 mg/kg）肌注，1次/d，持续4周。同时，模型组与治疗组继续给予40%四氯化碳榄油溶液皮下注射，直至16周。

1.2.3 标本采集 麻醉采用3%水合氯醛，麻醉后打开腹腔，取肝右叶组织（1 cm×1 cm×1 cm）标本，0.9%生理盐水冲洗，后经固定，脱水、石蜡包埋，切片后行HE染色，用作病理织学检查。另取末段回肠组织6～8 cm，用0.9%生理盐水冲洗，分为4等份，2份用于肠道病理组织学及免疫组织化学检查；另外2份存储于液氮罐中，分别用于ELI⁃SA检测及RT⁃PCR检测。

1.3 评价指标

1.3.1 病理损伤评分标准 根据WALLACE等［11］结肠宏观评分系统来评估黏膜损伤的程度。溃疡：局灶性充血，无溃疡为1分；溃疡，无充血/肠壁增厚为2分；溃疡，一处发炎为3分；溃疡，两处或多处发炎为4分；主要伤口＞1 cm为5分；主要伤口＞2 mm为6～10分。附着力：轻微（结肠容易与其他组织分离）为1分；严重为2分。腹泻：肠壁增厚为1分。

1.3.2 TNF⁃α和IL⁃6检测 采用酶联免疫吸附（ELISA）测定法。将部分冷冻回肠组织切成片，加入少量的0.9%生理盐水研磨成匀浆，4 000 r/min离心20 min，取上清用于TNF⁃α和IL⁃6浓度的测定。严格按照TNF⁃α和IL⁃6 ELISA试剂盒（晶美生物工程有限公司，中国深圳）说明书步骤进行操作。

1.3.3 免疫组化检测 使用K75619A试剂盒（中山金桥生物科技有限公司，中国北京）进行免疫组织化学研究，可用于回肠内NF⁃κB p65的可视化观察。正常山羊血清封闭，室温孵育15 min，然后将载玻片与大鼠NF⁃κB p65的抗体（Santa Cruz Biotech，美国）一起温育，用苏木精复染，于光学显著镜下进行观察，胞浆或细胞核内的阳性表达呈黄色或棕色。于400倍放大倍率的视野中，随机计数100个细胞，计算染色的细胞的比例。

1.3.4 实时聚合酶链反应 通过RT⁃PCR检测在回肠组织中TNF⁃α、IL⁃6及NF⁃κB p65 mRNA的表达水平及凋亡基因Bcl⁃2和Bax的RNA的合成。根据市售总RNA提取试剂盒说明书（RNeasy Mini Kit，QIAGEN Inc.，日本）将分离的RNA逆转录并扩增。引物序列见表1。将总RNA（2 μg）在45℃逆转录60 min并在95℃变性10 min。然后进行PCR扩增，通过Quantity One软件（Bio⁃Rad，Hercules，CA，USA）进行拍照和定量分析。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.4 统计学方法 本研究所有数据采用SPSS 19.0进行统计学处理，计量数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差（one⁃way ANOVA）分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3组体质量及细胞因子表达比较 3组经实验干预后，对照组体质量无明显下降，TNF⁃α、IL⁃6、NF⁃κB p65处于低水平，与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）；模型组体质量明显下降，细胞因子TNF⁃α、IL⁃6、NF⁃κB p65处于高水平；治疗组体质量较模型组高，差异有统计学意义（P＜ 0.01），细胞因子TNF⁃α、IL⁃6、NF⁃κB p65较模型组低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 3组体质量、TNF⁃α、IL⁃6及NF⁃κB比较Tab.2 Comparison of body weight，TNF⁃α，IL⁃6 and NF⁃κB in the three groups±s

表2 3组体质量、TNF⁃α、IL⁃6及NF⁃κB比较Tab.2 Comparison of body weight，TNF⁃α，IL⁃6 and NF⁃κB in the three groups±s

注：与模型组相比，aP＜0.05，bP＜0.01

组别对照组模型组治疗组n 10 13 15体质量（kg）240.3±16.9b 194.9±18.5 227.4±18.8b TNF⁃α（pg/mL）46.63±18.73b 152.52±15.81 97.93±17.79a IL⁃6（pg/mL）50.88±22.13b 118.82±35.71 78.07±24.94a NF⁃κB p65（%）28.10±9.88b 78.67±8.49 52.20±11.04b

2.2 组织病理学结果 回肠组织的病理损伤评分见图1，未经治疗的模型组病理损伤评分显著高于对照组与治疗组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；经治疗后治疗组的损伤评分显著低于对照组，但要高于对照组，差异均具有统计学意义（P＜ 0.05）。

图1 回肠组织的病理损伤评分Fig.1 Pathological damage score of ileum tissue

各组HE的染色结果显示，正常的大鼠肠黏膜绒毛形态（图2A）；模型组染色结果显示，因溃疡杯状细胞减少，黏膜肌层和腺体损伤（图2B）；治疗组观察到杯状细胞增加和浸润性炎性细胞减少（图2C）。

2.3 TNF⁃α和IL⁃6在回肠组织中的浓度 与对照组相比，模型组的TNF⁃α和IL⁃6表达水平，显著上升，差异具有统计学意义（P＜0.01）；治疗组经OMT治疗后，TNF⁃α和IL⁃6表达水平下降，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.4 免疫组化结果 NF⁃κB p65主要于上皮细胞和巨噬细胞的细胞核和胞浆中表达。免疫组化结果显示，模型组NF⁃κB p65的表达水平最强（图3A），而对照组相对较弱（图3B），差异具有统计学意义（P＜0.01）。治疗组与模型组相比，NF⁃κB p65表达量较低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。模型组阳性染色细胞比例显着高于其他2组（P＜0.05），见表2。

2.5 回肠组织mRNA表达水平 见图4，模型组TNF⁃α、IL⁃6、Bax及NF⁃κB p65 mRNA的表达水平显著高于对照组，差异与其他各组具有统计学意义（P＜ 0.05）；治疗组TNF⁃α、IL⁃6、Bax及NF⁃κB p65 mRNA的表达水平显著低于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。而模型组的Bcl⁃2 mRNA的表达水平显著低于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），而治疗组的Bcl⁃2 mRNA 显著高于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

图2 3组回肠组织HE染色结果对比（×400）Fig.2 Comparison of HE staining results of three groups of ileum（× 400）

图3 3组回肠组织NF⁃κB p65免疫组织化学染色图（SP×400）Fig.3 Three groups of ileum tissue NF⁃κB p65 immunohistochemical staining（SP × 400）

图4 各组TNF⁃α、IL⁃6、NF⁃κB p65、Bcl⁃2及Bax mRNA的表达水平Fig.4 The expression levels of TNF⁃α，IL⁃6，NF⁃κB p65，Bcl⁃2 and Bax mRNA in each group

本研究结果显示，OMT可以有效改善四氯化碳制备的大鼠肝硬化模型回肠组织中的炎症、溃疡及细胞浸润等。同时OMT亦可对细胞因子进行调节，从而抑制回肠组织中NF⁃κB p65的表达。有研究显示，Cox⁃2、IL⁃1、IL⁃6、TNF⁃α和 TGF⁃β等炎症因子受NF⁃κB调节，以上炎症因子均可引起炎症及肝纤维化，对于肝硬化形成起着十分重要的作用［12］。炎症反应与肝细胞凋亡过程息息相关，这是肝纤维化的重要机制。当肝细胞经历细胞凋亡并且不能再生时，凋亡性肝细胞被丰富的细胞外基质代替［13］。

关于TNF⁃α参与肠黏膜屏障功能障碍的机制较为明确，TNF⁃α于炎症级联反应中扮演十分重要的角色，其具有产生快，到达高峰的时间短等特点［14］。TNF⁃α是急性肝衰竭细菌入侵肠黏膜的重要介质［15］。IL同属细胞因子，现在发现的IL家庭成员有15个，参与了诸多生理及病理反应［16］。其中IL⁃6是重要的致炎细胞因子，与肠黏膜屏障损伤显著相关［13］。研究［17］显示，肝硬化患者血浆中TNF⁃α和IL⁃6水平较高。同时本研究发现，经OMT治疗后，肠道TNF⁃α和IL⁃6水平下调及mRNA表达下降，大鼠肠黏膜屏障功能得到改善。表明OMT有一定的抗炎作用，可在一定程度上降低炎症因子的表达，达到保护肠屏障功能的作用。这与现有研究结果一致，肠道中TNF⁃α浓度水平的升高与肠屏障损失有关联［18］。同时，IL⁃6能改变培养的肠上皮细胞紧密连接蛋白Claudin⁃2的表达和肠道通透性［19］。故TNF⁃α和IL⁃6与肝硬化肠黏膜屏障损伤有密切关联。

NF⁃κB为淋巴细胞和巨噬细胞中关键的转录因子，参与免疫炎症应答过程［20］。NF⁃κB对各种基因的启动子具有调节作用，可对整个炎症过程进行调控。TOMASELLO等［21］研究表明，NF⁃κB p65是肠道感染的主要因素。本研究中，NF⁃κB p65表达量与细胞因子（IL⁃6和TNF⁃α）水平呈正相关，表明它们在肝硬化肠黏膜屏障的损伤中起着重要作用。因此，抑制NF⁃κBp65的表达是治疗肠黏膜屏障损伤的有效方法。NF⁃κB p65亦可介导炎症因子如IL⁃6基因的转录激活并调节其表达。本研究中，OMT可以减少NF⁃κB p65 mRNA及其相应蛋白的表达，同时可降低TNF⁃α和IL⁃6的表达水平。研究显示，NF⁃κB DNA可减少白细胞集聚，同时亦可使IL⁃6和TNF⁃α浓度水平下降，从而达到治疗肠道感染的效果［22］。

此外，考虑到Bcl⁃2/Bax信号传导是线粒体凋亡途径的关键，是内源性细胞凋亡的重要调节因子，本研究通过检测Bcl⁃2、Bax的表达水平，研究其凋亡作用。研究显示，Bcl⁃2上调同时Bax下调，Bcl⁃2/Bax比例改变可抑制凋亡［23］。本研究结果与之一致，模型组Bax mRNA的表达水平显著高于对照组；治疗组Bax mRNA的表达水平显著低于模型组。而模型组的Bcl⁃2 mRNA的表达水平显著低于对照组（P＜0.05），治疗组的Bcl⁃2 mRNA 显著高于模型组（P＜0.05）。总之，NF⁃κB p65信号传导和Bcl⁃2/Bax信号协同支持肝细胞存活并抑制肝纤维化的发生。

综上，OMT可以通过调节NF⁃κB p65信号传导来明显改善CCl4诱导的肝纤维化，通过Bcl⁃2/Bax比例改变抑制肝细胞凋亡。然而，OMT作为肝纤维化治疗剂的作用需要进一步研究，需要对OMT的抗纤维化作用机制进行更加深入全面的了解。

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